应用锚定PCR技术对TCRδ链进行分析
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应用锚定PCR技术对TCRδ链进行分析
【操作方法】
（1） 提取外周血淋巴细胞总RNA；
（2） 利用oligo-dT或特异的C区序列作引物,在逆转录酶作用下合成第一条cDNA链；
（3） 于cDNA 3’末端添加Poly(dG)尾反应液(含2mmol/L CoCl2 ,1 mmol/L dGTP)和脱氧核酸末端转移酶(TdT)，37℃×1h;70℃终止反应，用乙醇沉淀DNA；
（4） PCR扩增：基因5’端使用与J区序列配对的特异引物Jgrl，含Sal1内切酶位点，3’端即加poly(dG)尾端，引物为AN PolyC Primer和AN Primer 1:9的混合物。反应体积100μl，变性94℃×1min，退火55℃×1.5min， 链延伸72℃×2.5min，最初5个循环在45℃退火。反复进行25个循环。用乙醇沉淀扩增产物；
AN PolyC 引物(带anchor的Poly(dC)引物):5’―GCATGCGCGGCCGCGGACCCCCCCCCCC
AN 引物(anchor引物):5’―GCATGCGCGCGGCCGGGGAGGCC
含Sac∏,SphI,NotI和SfiI位点。
（5） 电泳鉴定扩增产物；
（6） 特异限制性内切酶消化,克隆,转化宿主细胞,序列分析,表达研究等。
PCR第一循环中DNA合成是由anchor-poly(dC)引物(ANpolyC) 和5’端引物引导合成。Anchor的加入有两个作用:一是限定3’末端,防止PCR过程中3’末端可能沿同聚物尾不断的延伸;再则增加酶切位点或其他序列信息,利于基因克隆等操作。锚定-PCR对于分析免疫球蛋白、TCR甚至未知序列基因等具有特殊价值。
