大肠杆菌感受态细胞转化实验正负对照实验方法

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转化

A.将-70 0C下保存的感受态细胞(200μl)，室温下解冻后放置于冰上。

B.将ND-PUCm-T质粒DNA溶液(不超过50ng)或PCR 产物与pUCm-T质粒的连结产物，体积不超过10μl，轻轻摇匀，冰上放置30min。

C.42 0C水浴中热击90s或370C水浴中热击5min，热击后迅速置于冰上冷却3-5min。

D.向管中加入预热的1 ml LB液体培养基(不含Ampr)，混匀后370C下震荡培养1小时使细胞恢复正常生长状态，并表达质粒 编码的抗生素抗性基因(Ampr)。

E.取上述菌液20-100l涂布于含Amp的筛选平板上，正面向上放置半小时，等菌液完全干后倒置平皿370C下培养16-24hr。

对照 1：以蒸馏水代替pUC质粒 DNA，其它同上。

对照 2：以蒸馏水代替pUC质粒 DNA，在步骤E 中，取5μl涂布于不含Amp的筛选平板上。

计算：转化子总数=菌落数×稀释倍数×转化反应总体积/涂布体积

转化频率= 转化子总数/质粒 DNA量

感受态细胞总数=对照2菌落数×稀释倍数×菌液总体积/涂板菌液体积

感受态细胞转化效率=转化子总数/感受态细胞总数