PCR扩增出非特异带但无特异带,是不是引物的特异性不好？
丁香园论坛
2631
欲通过RT-PCR检测一种基因的不同剪接异构体表达情况，
在文献(cancer research, oncogene)中查到的两对引物序列如下：
P1 5' atg agg atc cca tgg gcc agc a 3'
P2 5' aag ggc ttt tca ctt gtt tta c 3'
P1 5' atg agg atc cca tgg gcc agc a 3'
P3 5' aag ggc ttt tca cct gta tga g 3'
RT用的是MBI的试剂盒,反应体系20ul：总RNA 4.0 ug, oligo 1 ul,M-Mulv 1 ul,反应条件为70℃5分钟,37℃5分钟,42℃60分钟,70℃10分钟.
PCR体系25ul：
cDNA 5ul
Mgcl2 1.0mM
dNTP 200uM
引物 0.2uM
TaQ酶 1U
PCR条件94℃1min---51℃1min（还试过55℃1min） ---72℃ 1min---35cycles----72℃ 5min. (文献中退火温度是个大致范围50-60℃)
结果出现了两三条非特异性条带，郁闷的是均并没有预计大小的特异性扩增带，不知是引物有问题，还是需要进一步改变反应条件？急盼各位高手帮忙分析一下引物及反应条件，并请指教该如何改动。不胜感激！
另附mRNA全序列为：
1 ggggtaagga gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc gaccgcctgt
61 ccgctccccc acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca cccacccaga
121 gccgggacgg cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat cctggacttc
181 ctcttgctgc aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca gcacacgctc
241 cgctccgggc ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga cccgggcggc
301 atctgggcca agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg ccggaggagc
361 cgcggggcgt ccgggtctga gccgcagcaa atgggctccg acgtgcggga cctgaacgcg
421 ctgctgcccg ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc tgtgagcggc
481 gcggcgcagt gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc ttacgggtcg
541 ttgggcggcc ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc gcctcactcc
601 ttcatcaaac aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca gtgcctgagc
661 gccttcactg tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg tcgctacggg
721 cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac
781 gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc
841 acggtcacct tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag
901 ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag
961 cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc
1021 ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca
1081 tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt aaagggagtt
1141 gctgctggga gctccagctc agtgaaatgg acagaagggc agagcaacca cagcacaggg
1201 tacgagagcg ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg
1261 cacggtgtct tcagaggcat tcaggatgtg cgacgtgtgc ctggagtagc cccgactctt
1321 gtacggtcgg catctgagac cagtgagaaa cgccccttca tgtgtgctta cccaggctgc
1381 aataagagat attttaagct gtcccactta cagatgcaca gcaggaagca cactggtgag
1441 aaaccatacc agtgtgactt caaggactgt gaacgaaggt tttctcgttc agaccagctc
1501 aaaagacacc aaaggagaca tacaggtgtg aaaccattcc agtgtaaaac ttgtcagcga
1561 aagttctccc ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg taaaacaagt
1621 gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa
1681 ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga aacatgacca aactccagct ggcgctttga
1741 ggggtctccc tcggggaccg ttcagtgtcc caggcagcac agtgtgtgaa ctgctttcaa
1801 gtctgactct ccactcctcc tcactaaaaa ggaaacttca gttgatcttc ttcatccaac
1861 ttccaagaca agataccggt gcttctggaa actaccaggt gtgcctggaa gagttggtct
1921 ctgccctgcc tacttttagt tgactcacag gccctggaga agcagctaac aatgtctggt
1981 tagttaaaag cccattgcca tttggtgtgg attttctact gtaagaagag ccatagctga
2041 tcatgtcccc ctgacccttc ccttcttttt ttatgctcgt tttcgctggg gatggaatta
2101 ttgtaccatt ttctatcatg gaatatttat aggccagggc atgtgtatgt gtctgctaat
2161 gtaaactttg tcatggtttc catttactaa cagcaacagc aagaaataaa tcagagagca
2221 aggcatcggg ggtgaatctt gtctaacatt cccgaggtca gccaggctgc taacctggaa
2281 agcaggatgt agttctgcca ggcaactttt aaagctcatg catttcaagc agctgaagaa
2341 aaaatcagaa ctaaccagta cctctgtata gaaatctaaa agaattttac cattcagtta
2401 attcaatgtg aacactggca cactgctctt aagaaactat gaagatctga gatttttttg
2461 tgtatgtttt tgactctttt gagtggtaat catatgtgtc tttatagatg tacatacctc
2521 cttgcacaaa tggaggggaa ttcattttca tcactgggag tgtccttagt gtataaaaac
2581 catgctggta tatggcttca agttgtaaaa atgaaagtga ctttaaaaga aaatagggga
2641 tggtccagga tctccactga taagactgtt tttaagtaac ttaaggacct ttgggtctac
2701 aagtatatgt gaaaaaaatg agacttactg ggtgaggaaa tccattgttt aaagatggtc
2761 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttg tgttgtgttt tgttttttaa gggagggaat
2821 ttattattta ccgttgcttg aaattactgt gtaaatatat gtctgataat gatttgctct
2881 ttgacaacta aaattaggac tgtataagta ctagatgcat cactgggtgt tgatcttaca
2941 agatattgat gataacactt aaaattgtaa cctgcatttt tcactttgct ctcaattaaa
3001 gtctattcaa aaggaaaaaa aaaaaaaaaa
在文献(cancer research, oncogene)中查到的两对引物序列如下：
P1 5' atg agg atc cca tgg gcc agc a 3'
P2 5' aag ggc ttt tca ctt gtt tta c 3'
P1 5' atg agg atc cca tgg gcc agc a 3'
P3 5' aag ggc ttt tca cct gta tga g 3'
RT用的是MBI的试剂盒,反应体系20ul：总RNA 4.0 ug, oligo 1 ul,M-Mulv 1 ul,反应条件为70℃5分钟,37℃5分钟,42℃60分钟,70℃10分钟.
PCR体系25ul：
cDNA 5ul
Mgcl2 1.0mM
dNTP 200uM
引物 0.2uM
TaQ酶 1U
PCR条件94℃1min---51℃1min（还试过55℃1min） ---72℃ 1min---35cycles----72℃ 5min. (文献中退火温度是个大致范围50-60℃)
结果出现了两三条非特异性条带，郁闷的是均并没有预计大小的特异性扩增带，不知是引物有问题，还是需要进一步改变反应条件？急盼各位高手帮忙分析一下引物及反应条件，并请指教该如何改动。不胜感激！
另附mRNA全序列为：
1 ggggtaagga gttcaaggca gcgcccacac ccgggggctc tccgcaaccc gaccgcctgt
61 ccgctccccc acttcccgcc ctccctccca cctactcatt cacccaccca cccacccaga
121 gccgggacgg cagcccaggc gcccgggccc cgccgtctcc tcgccgcgat cctggacttc
181 ctcttgctgc aggacccggc ttccacgtgt gtcccggagc cggcgtctca gcacacgctc
241 cgctccgggc ctgggtgcct acagcagcca gagcagcagg gagtccggga cccgggcggc
301 atctgggcca agttaggcgc cgccgaggcc agcgctgaac gtctccaggg ccggaggagc
361 cgcggggcgt ccgggtctga gccgcagcaa atgggctccg acgtgcggga cctgaacgcg
421 ctgctgcccg ccgtcccctc cctgggtggc ggcggcggct gtgccctgcc tgtgagcggc
481 gcggcgcagt gggcgccggt gctggacttt gcgcccccgg gcgcttcggc ttacgggtcg
541 ttgggcggcc ccgcgccgcc accggctccg ccgccacccc cgccgccgcc gcctcactcc
601 ttcatcaaac aggagccgag ctggggcggc gcggagccgc acgaggagca gtgcctgagc
661 gccttcactg tccacttttc cggccagttc actggcacag ccggagcctg tcgctacggg
721 cccttcggtc ctcctccgcc cagccaggcg tcatccggcc aggccaggat gtttcctaac
781 gcgccctacc tgcccagctg cctcgagagc cagcccgcta ttcgcaatca gggttacagc
841 acggtcacct tcgacgggac gcccagctac ggtcacacgc cctcgcacca tgcggcgcag
901 ttccccaacc actcattcaa gcatgaggat cccatgggcc agcagggctc gctgggtgag
961 cagcagtact cggtgccgcc cccggtctat ggctgccaca cccccaccga cagctgcacc
1021 ggcagccagg ctttgctgct gaggacgccc tacagcagtg acaatttata ccaaatgaca
1081 tcccagcttg aatgcatgac ctggaatcag atgaacttag gagccacctt aaagggagtt
1141 gctgctggga gctccagctc agtgaaatgg acagaagggc agagcaacca cagcacaggg
1201 tacgagagcg ataaccacac aacgcccatc ctctgcggag cccaatacag aatacacacg
1261 cacggtgtct tcagaggcat tcaggatgtg cgacgtgtgc ctggagtagc cccgactctt
1321 gtacggtcgg catctgagac cagtgagaaa cgccccttca tgtgtgctta cccaggctgc
1381 aataagagat attttaagct gtcccactta cagatgcaca gcaggaagca cactggtgag
1441 aaaccatacc agtgtgactt caaggactgt gaacgaaggt tttctcgttc agaccagctc
1501 aaaagacacc aaaggagaca tacaggtgtg aaaccattcc agtgtaaaac ttgtcagcga
1561 aagttctccc ggtccgacca cctgaagacc cacaccagga ctcatacagg taaaacaagt
1621 gaaaagccct tcagctgtcg gtggccaagt tgtcagaaaa agtttgcccg gtcagatgaa
1681 ttagtccgcc atcacaacat gcatcagaga aacatgacca aactccagct ggcgctttga
1741 ggggtctccc tcggggaccg ttcagtgtcc caggcagcac agtgtgtgaa ctgctttcaa
1801 gtctgactct ccactcctcc tcactaaaaa ggaaacttca gttgatcttc ttcatccaac
1861 ttccaagaca agataccggt gcttctggaa actaccaggt gtgcctggaa gagttggtct
1921 ctgccctgcc tacttttagt tgactcacag gccctggaga agcagctaac aatgtctggt
1981 tagttaaaag cccattgcca tttggtgtgg attttctact gtaagaagag ccatagctga
2041 tcatgtcccc ctgacccttc ccttcttttt ttatgctcgt tttcgctggg gatggaatta
2101 ttgtaccatt ttctatcatg gaatatttat aggccagggc atgtgtatgt gtctgctaat
2161 gtaaactttg tcatggtttc catttactaa cagcaacagc aagaaataaa tcagagagca
2221 aggcatcggg ggtgaatctt gtctaacatt cccgaggtca gccaggctgc taacctggaa
2281 agcaggatgt agttctgcca ggcaactttt aaagctcatg catttcaagc agctgaagaa
2341 aaaatcagaa ctaaccagta cctctgtata gaaatctaaa agaattttac cattcagtta
2401 attcaatgtg aacactggca cactgctctt aagaaactat gaagatctga gatttttttg
2461 tgtatgtttt tgactctttt gagtggtaat catatgtgtc tttatagatg tacatacctc
2521 cttgcacaaa tggaggggaa ttcattttca tcactgggag tgtccttagt gtataaaaac
2581 catgctggta tatggcttca agttgtaaaa atgaaagtga ctttaaaaga aaatagggga
2641 tggtccagga tctccactga taagactgtt tttaagtaac ttaaggacct ttgggtctac
2701 aagtatatgt gaaaaaaatg agacttactg ggtgaggaaa tccattgttt aaagatggtc
2761 gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgttg tgttgtgttt tgttttttaa gggagggaat
2821 ttattattta ccgttgcttg aaattactgt gtaaatatat gtctgataat gatttgctct
2881 ttgacaacta aaattaggac tgtataagta ctagatgcat cactgggtgt tgatcttaca
2941 agatattgat gataacactt aaaattgtaa cctgcatttt tcactttgct ctcaattaaa
3001 gtctattcaa aaggaaaaaa aaaaaaaaaa
