一文理清免疫荧光实验流程和常见问题

免疫荧光（immunofluorescence）是一种常用的光学显微术，即用荧光显微镜来观察细胞中的特定生物分子。免疫荧光依赖于抗体抗原的特异性结合，然后通过直接标记或间接标记方法使用荧光分子指征抗体-抗原结合的位置，以确定目标生物分子在细胞中的位置、丰度和分布情况。
 

免疫荧光实验流程

1. 固定

固定液种类：有机溶剂（甲醇、乙醇、丙酮等）；交联剂（4%PFA、10%中性福尔马林），固定液的选择取决于被研究抗原的性质及所用抗体的特性。但针对磷酸化的抗体，不适合用甲醛，会导致磷酸蛋白从膜表面转移到胞浆中，故应选择冰冷的无水甲醇或无水乙醇，同时应注意甲醛会挥发，在4-8°C不宜储存太久。

固定时间：取决于组合块的大小和类型，对于大多数组织，18-24h较为理想，细胞固定时间较短，一般2%的甲醛室温固定20min即可。

2. 透化

通透的目的是使抗体进入胞内。0.5% Triton X-100 室温通透20 min（针对胞内抗原，若是细胞膜上表达的抗原则省略该步骤）；除了Triton X-100，丙酮也可作为通透剂，并且丙酮固定后的样品不需要通透。

3. 封闭

封闭可减少一抗和二抗与非特异性位点结合。通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清，室温封闭30min。常用的封闭液包括：与二抗同一来源的血清、BSA或者是羊血清。从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。醛类固定的样品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封闭液进行封闭。

4. 一抗孵育

根据一抗说明书，按照适当比例用一抗稀释液稀释一抗，用吸水纸吸尽封闭液，每张玻片滴加稀释好的一抗并放入湿盒， 4℃孵育过夜。回收一抗，加入PBST， 在摇床上缓慢摇动洗涤5 min，共洗涤3次。

5. 荧光二抗孵育

用吸水纸吸尽洗涤液后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中孵育1h后，回收二抗，接着用PBST洗3次，每次5 min；由于荧光容易淬灭，故从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都要避光。 

6. 复染核（定位的关键）

在玻片上滴加DAPI，并注意避光孵育5min，对标本进行染核，然后用PBST洗3次，每次5min，洗去多余的DAPI。

7. 封片

用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察。
 

免疫荧光常见问题

一、荧光信号弱怎么办？

从样本本身、固定透化到抗体孵育，甚至是拍照，每一步都有可能是原因。

1. 样品质量

选用新鲜制备的样本以及适当的保持条件。

2. 靶标丰度低

• 适当提高一抗浓度。

• 选择荧光强度更强的二抗，比如Alexa Fluor系列二抗。

3. 固定方法不当

• 甲醛和蛋白的氨基通过共价键结合，可能会遮盖抗原表位，导致靶表位信号减弱。建议调整抗原修复方法或固定方法。

• 多聚甲醛会与GFP荧光蛋白发生醛化反应，导致信号减弱。

• 检测膜蛋白一般不建议使用甲醇或丙酮固定，有机溶剂能够破坏膜结构。

4. 透化方法不当

• 检查靶标蛋白表达位置，胞内蛋白需要透化处理。

• 膜蛋白需要考虑所检测靶表位位于膜内还是膜外，膜外则不需要透化。

5. 二抗选择不当

二抗选择建议如下：

6. 信号放大不够

如果检测靶点是低丰度蛋白．信号弱可能是由于信号放大不足导致的，可以使用Invitrogen SuperBoost 酪胺信号放大技术，进一步增强信号，实现低丰度，难以检测蛋白的检测。

7. 光漂白

• 减少照明强度/时间。

• 选用抗荧光淬灭封片剂。
   

二、背景太高了怎么办？

大家在操作时可以通过设置对照，帮助我们迅速判断背景的来源。对照包括自发荧光对照（无一抗、二抗）和无一抗对照。

1. 封闭不足

• 选用二抗种属来源的血清封闭。

• 选用链霉亲和素/生物素系统，需要用链霉亲和素封闭内源的生物链酶。

• 选用HRP系统，需要使用过氧化氢等商业化试剂盒去活化内源性HRP。

• 选用AP系统，需要使用左旋咪唑等商业化试剂去活化内源性磷酸酶。

2. 一抗

一抗浓度过高，减少用量

3. 二抗

• 设置无一抗对照，帮助确认背景是否来源二抗。

• 二抗浓度过高，减少用量。

• 抗体凝聚，使用二抗前离心去掉抗体凝聚物。

• 使用高交叉吸附的Alexa Fluor Plus二抗，信噪比比Alexa Fluor提高4-5倍。

4. 自发荧光

• 设置自发荧光对照，确定是否自发荧光。

• 固定剂如醛类和氨基共价结合导致的自发荧光，可用NaBH4去除。

• 增加固定剂的漂洗次数。

• 避开背景高的波段，选用背景较低的波段检测。