real-time PCR技术的原理及应用

一、实时荧光定量PCR原理

（一）定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法 。

（二）实时原理

1、常规PCR技术：

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测。

2、实时定量PCR技术：

利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析

3、如何对起始模板定量？

通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析.

4、几个概念：

（1）扩增曲线 ：

（2） 荧光阈值：

（3）Ct值：

CT值的重现性：

5、定量原理：

理想的PCR反应： X=Xundefined2n

非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n

n：扩增反应的循环次数

X：第n次循环后的产物量

X0：初始模板量

Ex：扩增效率

5、标准曲线

6、绝对定量

1）确定未知样品的 C(t)值

2）通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量

二、实时荧光定量PCR的几种方法介绍

方法一：SYBR Green法

（一）工作原理

1、SYBR Green  能结合到双链DNA的小沟部位

    

 2、SYBR Green  只有和双链DNA结合后才发荧光

3、变性时，DNA双链分开，无荧光

4、复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

PCR反应体系的建立及优化:

 1、SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测
 　　2、Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准
 　　3、MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物
　　4、反应Buffer 体系的优化
　　5、反应温度和时间参数:由酶和引物决定
　　 6、其他与常规PCR相同

（二）应用范围

1、起始模板的测定；
　　2、 基因型的分析；
　　3、 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。

（三）优点及缺点

优点：对DNA模板没有选择性；适用于任何DNA； 使用方便；不必设计复杂探针；非常灵敏； 便宜。

 缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性；但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件；   对引物特异性要求较高。

方法二：TaqMan---水解型杂交探针

 *5′端标记有报告基团(Reporter, R)  ，如FAM、VIC等 
　　*3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q)
　　*_探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光
　　*Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针

（一）工作原理

注意：每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光

PCR反应的建立：

1、引物、探针的设计：

 探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
　　引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃

2、反应参数的确定：

一般为：94 ℃，10-20S
　　 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高）
　　 也可通过温度梯度优化退火温度72 ℃，45 S，

3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，信号/背景比值的最大值 
　　 引物浓度：50-900nM
　　 探针浓度：50-250nM

4、其他与常规PCR相同

（二）优缺点

优点：
　　对目标序列的高特异性
      　　  ------阴性结果确定
　　设计相对简单
      　　 ------与目标序列某一区域互补
　　重复性比较好

缺点：
　　只适合一个特定的目标;
　　委托公司标记，价格较高;
　　不易找到本底低的探针