化学发光羧基磁珠偶联SA和抗体的实验技术指南
苏州为度生物技术有限公司
化学发光免疫分析技术是目前世界公认的先进的免疫诊断技术，具有灵敏度高、特异性强、检测线性范围宽等优势，现已广泛应用于肿瘤标志物、传染病、内分泌功能和激素等方面的诊断。磁珠法化学发光免疫技术是将磁性分离技术、化学发光技术和免疫分析技术三者相结合的分析方法。磁珠在化学发光免疫分析技术中起到载体的作用，可以偶联抗体、抗原或者链霉亲和素等。为度生物作为一家专注于磁珠开发与创新的公司，我们将在本文介绍羧基磁珠偶联链霉亲和素（SA）和抗体的实验方法及偶联实验过程中的一些注意事项。
一、羧基磁珠偶联链霉亲和素（SA）和抗体的原理
EDC通过与磁珠上的羧基进行反应，形成一种促发剂——不稳定的脲衍生物，NHS通过形成更稳定的酯而增强碳二亚胺交联产物的稳定性。交联过程中EDC、NHS不进入最终产物中，而是转变成水溶性的脲衍生物。
二、羧基磁珠偶联链霉亲和素（SA）
1.1. 活化剂：EDC和NHS
1.2. 反应温度：37℃环境
1.3. 反应时间：
1.3.1.偶联时间：2h
1.3.2.封闭时间：1h
1.4. 封闭要求：封闭时间不宜小于1h。
2. 偶联流程
2.1. 配制偶联实验所用的缓冲液，分别有以下几种：
2.1.1 偶联液：100mM MES pH4.8
2.1.2 封闭液：3M Ethanolamine，1%BSA，0.5%T-20，pH8.0
2.1.3 保存液：0.05%proclin-300的PBS缓冲液或者根据自己的需求配制其他缓冲液。
2.2. 先将磁珠用旋涡振荡器混匀，磁珠用量根据所需取用，置于EP管中，加入偶联液，使磁珠的终浓度为5mg/mL，使用旋涡振荡器混匀，后置于磁性分离架上，富集磁珠，去除上清，后再加入偶联液重复清洗一次。
2.3. 计算所需SA的体积，先加入偶联液，旋涡震荡混匀，再加入EDC和NHS，最后加入SA，然后继续旋涡混匀，后置于37℃环境旋转混匀反应2h。EDC与NHS的比例为1:1，此偶联反应中，EDC和NHS的终浓度都是1.5mg/ml，SA与磁珠的比例为1:25，磁珠的终浓度亦为5mg/mL。
2.4. 偶联反应完成后，将EP管置于磁性分离架上，去除上清，加入封闭液，此时，磁珠的终浓度为5mg/mL，同样置于37℃环境旋转混匀反应1h。
2.5. 封闭完成后，重复2.2步骤，最后将磁珠用保存液保存，此时磁珠的浓度可自定。
三、羧基磁性微球偶联抗体
1. 偶联条件
1.1. 活化剂：EDC和NHS
1.2. 反应温度：37℃环境
1.3. 反应时间：
1.3.1.活化时间：30min
1.3.2.偶联时间：2h
1.3.3.封闭时间：1h
1.4. 封闭要求：封闭时间不宜小于1h。
2. 偶联流程：
2.1. 先将偶联所用的缓冲液配制好，分别有以下几种：
2.1.1 偶联液：100mM MES pH4.8
2.1.2 封闭液：3M Ethanolamine，1%BSA，0.5%T-20，pH8.0
2.1.3 保存液：0.05%proclin-300的PBS缓冲液或者根据自己的需求配制其他缓冲液。
1. 当蛋白浓度≥2mg/mL，会增加磁珠与蛋白的接触面积，使得磁珠在单位面积内捕获相对更多的蛋白，偶联效率会增高，但需根据成本和使用要求综合考虑。
2. 偶联液中不能带有伯氨基的成分，比如Tris，甘氨酸，BSA等。在羧基磁珠与蛋白的偶联过程中，是通过磁珠上面的羧基与蛋白的氨基缩合反应形成，所以在偶联过程中，偶联液中不能带有伯氨基的成分。
3. EDC和NHS溶液需要现配现用。EDC容易受潮和降解，较好的情况是现配现用，以保证实验过程的可靠性。
4. 偶联过程中的各种条件可依据具体情况做适当调整。
为度生物化学发光磁性微球
