PCR实验操作

PCR是极为重要的DNA增殖技术，应用层面非常广，其中包括了核酸探针的制备。如果一段DNA已经被次选殖至载体上，要以PCR扩增这段DNA时，可根据质体multiple cloning sites两边的序列，选用适当的核酸引子 （universal primers） 进行扩增反应；比较常用的引子包括SP6, T3 与T7 promoter primer, M13/pUCforward与reverse primers等；若有特殊考量，也可以使用序列专一性核酸引子对。进行PCR反应时若同时添加 [α-32P]dNTP或DIG-11-dUTP,所增殖的DNA即被32P或DIG所标定，所以PCR是制备核酸探针非常便捷好用的方法。

仪器用具：微量离心机；PCR 反应器

药品试剂：

模版DNA: pBlueGus 质体DNA （~50 pg）

核酸引子对： T3 promoter primer 与T7 promoter primer （各2 μM）

矿物油 （是否需要视PCR反应器机型而定）

PCR DIG probe synthesis kit （Roche）， 内含：

Taq DNA polymerase （Expand High Fidelity, 3.5 U/μL）

10×PCR DIG probe synthesis mix （2 mM dATP, dCTP, dGTP, 1.9 mM dTTP,及0.1 mM DIG-11-dUTP, pH 7.0）

Expand high fidelity buffer with MgCl2 （10×）

方法步骤：

以下反应条件主要参照PCR DIG probe synthesis kit 制造厂商所提供的产品说明。

1） 取一支0.5 mL微量离心管，依下表逐一加入各项试剂 （单位 μL）：

2） 以手指头轻弹管壁使各项试剂混合均匀。

3） 短暂离心后，徐徐加入100 μL 矿物油。

◆ 有些PCR 反应器不需使用矿物油。

4） 在PCR 反应器上设定PCR 反应条件：Denaturation: 94℃/10 min

扩增反应：

30 循环的 [94℃/45 s → 55℃/1 min → 72℃/2 min]

最后的elongation step:72℃/10 min

5） 将微量离心管移至反应器上，并开始进行PCR 反应。

6） 反应完成后，以微量移液器吸出矿物油，并取出5 μL PCR 反应产物，进行洋菜胶体电泳分析。