构建人VH基因节段文库

构建人VH基因节段文库

[器材和试剂]

●  PCR试剂和设备

●  自pHENl中天然scFv文库制备的scFv基因文库模板DNA（单链和双链DNA 10ng/ul）

●  Genecle&n试剂盒（Qbiogene）

●  PVH3FoR1引物：  5'-TCG CGC GCA GTA ATA CAC GGC CGT GTC-3'

●  PVH3FORl引物：  5'-TCG CGC GCA GTA ATA CAC AGC CGT GTC CTC-3'

●  PVlJ5FORl引物：  5'-TCG CGC GCA GTA ATA CAT GGC GGT GTC CGA-3,

●  LMB3引物

[方法]

1、配制3个各自独立的50ul PCR反应混合液，包含：

●  水，35.5u1

●  20×dNTP,2.5ul

●  10×Vent聚合酶缓冲液，5.0ul

●  LMB3引物（10pmol/ul），2.5ul

●  FORWARD引物  （10pmol/u1），2.5ul

●  scFv基因模板DNA（10ng），1.0u1

●  VentDNA聚合酶（2单位），1.0u1

2、在有加热盖的热循环仪内加热反应物到94℃，5分钟。

3、以94℃30秒、42℃30秒、72℃1分钟的条件共循环25次，扩增VH基因。

4、在1.5%琼脂糖胶上胶纯化VH基因文库并用Genecleall试剂盒提取DNA.将每种产物重悬于20ul水中。在1.5%琼脂糖胶上，与已知大小和浓度的标准对照品比较，测定DNA浓度。