引物设计实例分析(多图)

引物设计基本原则
引物长度（primer length）
产物长度（product length）
序列Tm值 （melting temperature）
G+C含量（composition）
引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）
阅读框

1. 引物的长度

一般为15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38,因为过长会导致其延伸温度大于74℃，即Taq酶的最适温度

2. 产物的长度

扩增片段长度为100~600碱基对。

3. Tm值

引物的Tm值一般控制在55-60度， 尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2度。 如果引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。

Tm=2（A+T）+4（C+G）

4. 引物的GC含量

有效引物中（G+C）的比例为40-60%,过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

5. 引物自身

引物间3‘端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败

任务

用绿色荧光蛋白（GFP）标记蛋白NR1

引物要求

PCR扩增GFP

GFP两边添加BamHI酶切位点

保证NR1的阅读框不改变

第一步：扩增GFP基本序列

第二步：GC比值；Tm值

第三步：酶切位点

第四步：阅读框

第五步  保护序列

Primer1: 5'    GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA

Primer2: 5'   GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC