多重PCR反应中退火温度的优化

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将退火时间从 20 秒改为两分钟并未改变扩增效率，但退火温度 却是最重要的参数之一。尽管许多基因能在退火温度为 56 ℃ –60 ℃被特异的扩增，我们的经验表明 将退火温度降低 4 ℃ –6 ℃对于在多重 PCR 中扩增出同样的基因是必需的。单独扩增时退火温度为 60 ℃的基因在多重 PCR 中退火温度为 54 ℃时最优。尽管在 54 ℃时可能出现非特异性扩增(如 Figure 3c )，但多重反应中并发的其他基因的特异扩增会消除非特异性扩增的影响。相似的，当同时扩增许多特异的基因时，扩增效率高的基因会使扩增效率低的基因的扩增产量降低。这是由于在 PCR 反应中酶和 d NTP 的供应是有限的，所有的产物都是由同样的一组原料生成。