柔嫩艾美耳球虫卵囊的传代和收集
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实验步骤
1. 将保存在2.5%重铬酸钾中的柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊悬液离心10min(3000r/min),弃去上清,再用PBS重悬沉淀,重复洗涤2次,除去重铬酸钾;
2. 经口接种给饲养于无球虫环境下7日龄的小鸡,攻虫数量为孢子化卵囊5×104 个/只,感染后第8天扑杀所有攻毒的鸡只,解剖收取盲肠;
3. 收集的盲肠经过匀浆机匀浆,加入清水3000rpm离心15min,弃上清,用适当PBS重悬;
4. 加入胃蛋白酶(2毫克/毫升),调整PH为2.0,39℃处理1小时,过200目筛子;
5. 收集液体,3000rpm离心10分钟,弃去上清,沉淀用饱和食盐水漂浮,3000rpm离心15min,收集上清;
6. 上清中加入至少三倍体积清水,降低盐水浓度,再次3000rpm离心15min,弃上清;
7. 加入有效氯含量7%-10%的NaClO冰浴消化5min左右,加入3倍左右体积的清水稀释,3000rpm离心15min,收集沉淀;
8. 沉淀用2.5%重铬酸钾溶液吹打均匀,29℃通风孢子化,待孢子化率达到90%,将此卵囊收起贴上标签,4℃储存(最好储存少于半年)。