原理
将细胞悬浮在含美希索的培养基中，将这种细胞种于铺有琼脂（或琼脂糖）凝胶底层的培养皿中。
材料与仪器
Noble琼脂 Difco 胎牛血清 1.6%美希索
两倍浓度培养基 生长培养基 无菌超纯水 无菌锥形瓶 吸管 通用容器 培养皿 水浴 三角瓶 托盘 电子细胞计数仪 本生煤气喷灯
两倍浓度培养基 生长培养基 无菌超纯水 无菌锥形瓶 吸管 通用容器 培养皿 水浴 三角瓶 托盘 电子细胞计数仪 本生煤气喷灯
步骤
1. 按照 14.4 实验中步骤 1~7 制备琼脂凝胶底层。
2. 用等体积 2× 培养基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培养基配2× 培养基，取半量所需终液量，加两倍浓度的血清）稀释美希索（1.6 %美希索，4 Pa-S(4000cps)，以 UPW 溶解，置于冰上）至 0.8 % ，充分混匀，冰上保存。
3. 胰蛋白酶消化单层贴壁细胞，收集悬浮细胞或骨髓细胞，计数。
4. 制备以下稀释浓度的细胞，细胞的最高浓度为 1×105 /ml 。
(a)1×105 /ml
(b)将 1×105 /ml 稀释 3 倍成 3.3×104 /ml
(c)将 3.3×104 /ml 稀释 3 倍成 1.1×104 /ml
(d)将 1.1×104 /ml 稀释 3 倍成 3.7×103 /ml
美希索有黏性，用不带针头的注射器更容易操作。
5. 将四种稀释度分別标在 4 个小玻璃瓶或试管上，从每种稀释液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 稀释液，分別放人相应容器内，再向每个容器中加 4 ml 0.8 % 美希索培养基，用漩涡混旋器充分混匀，如果细胞特别脆弱，用注射器（用于分装美希索。由于黏稠，美希索会附着于吸管内壁，造成分装量不准确）上下轻柔地抽吸溶液几次，然后用注射器再从每个容器中吸出 3 个 1 ml 分别加在相应的三个培养皿上。最终浓度如下：
(a) 1×105 /ml/皿
(b) 330 /ml/皿
(c) 110 /ml/皿
(d) 37 /ml/皿
6. 将培养皿放置在加湿的温箱屮培养至集落形成。由于集落会在琼脂与美希索的界面形成，所以培养 1 周后添加新鲜培养基 1ml/皿或孔，2 周后在不影响集落的情况下，弃旧液，更换更多新鲜培养基。
2. 用等体积 2× 培养基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培养基配2× 培养基，取半量所需终液量，加两倍浓度的血清）稀释美希索（1.6 %美希索，4 Pa-S(4000cps)，以 UPW 溶解，置于冰上）至 0.8 % ，充分混匀，冰上保存。
3. 胰蛋白酶消化单层贴壁细胞，收集悬浮细胞或骨髓细胞，计数。
4. 制备以下稀释浓度的细胞，细胞的最高浓度为 1×105 /ml 。
(a)1×105 /ml
(b)将 1×105 /ml 稀释 3 倍成 3.3×104 /ml
(c)将 3.3×104 /ml 稀释 3 倍成 1.1×104 /ml
(d)将 1.1×104 /ml 稀释 3 倍成 3.7×103 /ml
美希索有黏性，用不带针头的注射器更容易操作。
5. 将四种稀释度分別标在 4 个小玻璃瓶或试管上，从每种稀释液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 稀释液，分別放人相应容器内，再向每个容器中加 4 ml 0.8 % 美希索培养基，用漩涡混旋器充分混匀，如果细胞特别脆弱，用注射器（用于分装美希索。由于黏稠，美希索会附着于吸管内壁，造成分装量不准确）上下轻柔地抽吸溶液几次，然后用注射器再从每个容器中吸出 3 个 1 ml 分别加在相应的三个培养皿上。最终浓度如下：
(a) 1×105 /ml/皿
(b) 330 /ml/皿
(c) 110 /ml/皿
(d) 37 /ml/皿
6. 将培养皿放置在加湿的温箱屮培养至集落形成。由于集落会在琼脂与美希索的界面形成，所以培养 1 周后添加新鲜培养基 1ml/皿或孔，2 周后在不影响集落的情况下，弃旧液，更换更多新鲜培养基。
来源：丁香实验
