请教关于RT-PCR实验的问题

刚刚接触RT-PCR实验,现在遇到一些问题.特向各位高人请教.
我做的是关于大鼠erg,mink,KvLQT的基因表达,引物是老板按照文献给的,源自于Circulation(2000;101:2007-2014),作者是日本人.非常困惑的是没有GENEBANK的NO,对于这些引物我非常想核对,但是无从谈起.硬着头皮做了,可是发现跑出的条带不对头,与Marker比较都大了许多,erg大约是900左右,这是不是就是所谓的基因污染,我第一步提取总RNA的时候就没有做好呢?请各位帮忙分析一下.(当时胶比较稀1.0%左右,索性就用了,对不起各位的眼睛了)

GADPH(373bp) Marker(从上到下1035,900,800,700,600,500,400,300,200...) erg(435bp)

即便是污染了,需要重新抽提和逆转录,是不是应该把引物换一下,至少做的心中有数,我自己设计了一下,因为是初学,借助软件没什么经验,请各位帮忙看看
(1)KvLQT1 NO:U92655
sense 5' GCC TCT ATG GTT GTC CTC T 3'
antisense 5' AGT GTT TCT GCC TCT GCT T 3'
223-690(468)

序列如下
1 ctggtctgcc tcatcttcag tgtcctgtcc actattgagc agtatgccgc tctggccacc
61 gggaccctct tctggatgga aattgtcctt gtggtgttct ttgggacaaa gtatgtggtc
121 cgtctctggt ctgcaggctg ccgcaccaag tacttgggca tctggggccg gctacgcttt
181 gcccggaagc ccatttccat catcgacctc atcgtggttg tagcctctat ggttgtcctc
241 tgtgtgggtt ccaaagggca agtgttcgcc acatcagcta tcaggggtat ccgcttcctt
301 caaatcctgc ggatgctgca tgttgatcgc cagggaggta cctggaggct cctgggctct
361 gtattcttca ttcaccgcca ggagctgatc accaccctgt acattggctt tctgggtctc
421 atcttctcct cctactttgt ctacctggct gagaaagatg cagtgaatga gtccggccgc
481 atcgagtttg gcagctacgc agatgctctg tggtggggag tggtcacagt caccaccatt
541 ggctacgggg ataaggtacc cagacatggg ttgggaagac catcgcctcc tgtttctctg
601 tcttcgccat atccttcttt gcactcccag cgggcatact tggctctggg tttgcactga
661 aggtccagca gaagcagagg cagaaacact tcaaccggca gatcccagcc gcagcctcac
721 tcatccagac tgcatggagg tgctatgctg cggagaatcc tgactcatcc acttggaaga
781 tctatgtccg gaagcctgct cggagccaca ctttgctctc ccccaagcct aaaaagtctg
841 tcatggtaaa gaagaagaag ttcaagctgg acaaagacaa t
(2)ERG NO:Z96106
sense 5' TCGGCAAGCCCTACAAC 3' 17
antisense 5' GGATAAACTCCCGCACCC 3' 18 (存在False Priming)
ERG 1784-2059(276)
不理想,但是我用软件找不到更好的. 序列太长,放在附件上

(3) Mink NO:M22412
sense 5' TTT TGC TCC ACA TCA GGG 3'
antisense 5' TGG CAG GTT GTT CTA CGG 3'
Mink 5-401(397)

对于Mink(KCNE1)的基因表达研究,在AM J Physiol Gastrointest Liver Physiol(282:G277-G287,2002),报道其引物的设计是
sense 5' AGA GTT TTG CTC CAC ATC AGG G 3' -40 TO -19
antisense 5' GAC CCA CTT ATC ACT TGT CTA T 3' 431-410
这究竟是为什么,上游序列的负值是什么意思?

序列如下:
1 cgtccatcca ggtccaggcg tgcagagttt tgctccacat cagggaaacc gtgaagcccc
61 aggatggccc tgtccaattc cacaactgtt ctgccttttc tggcctcgct gtggcaggaa
121 acagatgagc cgggtggcaa tatgtcggcg gacttggctc gtaggtccca gctccgagat
181 gacagcaagc tggaggctct ctatatcctc atggtgctgg gtttcttcgg cttcttcacc
241 ctgggcatca tgctgagtta catccgatcc aagaagctgg aacactcgca cgaccctttc
301 aacgtgtaca tcgagtcgga cgcctggcag gagaaaggca aggccctctt ccaggcccgc
361 gttctggaga gcttcagagc ttgctatgtc attgaaaacc aggcggccgt agaacaacct
421 gccacacacc ttcctgaact gaagccactg tcatgaaccc catagttaat taatagacaa
481 gtgataagtg ggtctttcta gtcaaatgcc tgccagtctt tattgtagag gtacccttga
541 gtttttataa ggggtgagtt aataacacca gttttctgaa attgc