连续120h的细胞杀伤分析助力TP53新型抗体发现

免疫细胞可识别并杀伤有害的靶细胞（如突发性肿瘤细胞），是人体宿主防御机制的一个重要组成部分。抗体依赖性细胞介导的细胞毒性 (ADCC) 和 T 细胞杀伤是细胞介导的免疫应答的两种机制，其中的每个过程都涉及刺激免疫细胞亚群（例如，自然杀伤 (NK) 细胞或细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL)），使它们主动裂解靶细胞。

近期，约翰霍普金斯大学医学院的研究人员在Science期刊发表研究成果[1]。他们发现了靶向TP53突变的新抗原，筛选出一种抗体片段（H2-scFv）特异性识别灭活的肿瘤抑制基因的蛋白质产物，通过实时监测T细胞杀伤效应，证实了该抗体片段的有效性，开创了靶向疗法的新领域。此研究中，Incucyte®被选择并应用于免疫细胞肿瘤杀伤活性的实时动态分析。
 

Incucyte® 实时活细胞分析系统

Incucyte®有什么优势呢？

免疫细胞肿瘤杀伤活性的体外评价过程涉及到免疫细胞和肿瘤细胞两种细胞存在，因此不能采用传统的细胞增殖活性检测手段（如MTT、ATP等方法）直接进行检测。目前常用的免疫细胞杀伤研究方法包括 51铬释放试验、流式细胞术、 ELISpot、3H 胸腺嘧啶和 ATP 检测。这些方法步骤繁琐，耗费时间和人力，很难实现对效应细胞和靶细胞之间相互作用的研究。Incucyte® 位于细胞培养箱内，可以长时程自动采集相差和荧光图片，实时观察并全自动分析肿瘤细胞杀伤和免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，配合Cell-By-Cell软件模块可以自动地完成图片的定量分析，直接测定肿瘤细胞的死亡及活力。


双特异性单链双抗体（H2-scDb）的鉴定

通过筛选一个展示 scFv 的噬菌体文库，针对包含 p53R175H 肽的 HLA-undefined02:01 pHLA 单体的阳性选择与针对包含 p53WT 和无关肽的 pHLA 单体的阴性选择相结合。实验中评估了几种双特异性抗体形式（例如双特异性 T 细胞接合剂 (BiTE)、双亲和重新靶向抗体 (DART) 和双抗体）后，选择了scDb 形式。根据不同生物学实验验证，筛选出特异性较高的克隆H2-scDb。


H2-scDb 特异性识别表达 p53R175H 新抗原的癌细胞

H2-scDb 识别表达不同量 HLA-undefined02:01 并具有不同 p53 突变状态的癌细胞系的能力，即使H2-scDb的浓度非常低，对T细胞的激活功能也是非常明显的，T 细胞反应导致靶细胞的有效杀伤，并且是多功能的，如细胞毒性颗粒蛋白颗粒酶 B 和穿孔素的释放以及细胞因子 IFN-γ、肿瘤坏死因子 α (TNF-α)、白细胞介素2 (IL-2) 等（图 2A）。肿瘤细胞周围的 T 细胞聚集，导致它们在 H2-scDb 存在下裂解，也通过Incucyte® 实时活细胞成像进行可视化(图 2B)。
 

图 2.（A）细胞毒性颗粒蛋白颗粒酶B和穿孔素的释放以及细胞因子IFN-γ、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）等曲线；（B）绿色荧光蛋白（GFP）标记的TYK-nu与T细胞共培养，E:T比为5:1，有或没有H2-scDb在Incucyte®系统中连续监测，显示24小时和96小时拍摄的相位和绿色荧光图像。

研究人员基于 CRISPR 的技术对携带内源性 HLA-undefined02:01 和 p53R175H 的 KMS26、KLE 和 TYK-nu 癌细胞系中的 TP53 进行了基因破坏。H2-scDb 介导的细胞毒性通过破坏这些细胞中的 TP53 类似地减轻，通过Incucyte® 连续检测超过120h，呈现动态的定量化杀伤效果(图3)。
 

图 3. TP53野生型（左）或突变型（右）的绿色荧光蛋白（GFP）标记的TYK-nu细胞中加入不同浓度的H2-scDb和T细胞以E:T为2:1的比例进行共培养。实时活细胞成像检测TYK-nu细胞的生长。

文章讨论了该抗体片段（H2-scFv），可以特异性识别灭活的肿瘤抑制基因的蛋白质产物，而不识别完整细胞中的 WT 形式，且对蛋白质的突变形式具有特异性。H2 (H2-scDb) 构建的双特异性抗体可以激活 T 细胞，诱导多功能 T 细胞效应反应，包括细胞毒活性和多种细胞因子的产生，更好的诠释了T细胞对肿瘤杀伤的效果。因此，可以将该双特异性抗体作为新型抗体疗法的突破口。

 

 总结 

在观察免疫杀伤时，往往需要通过长时间的药物处理，比如ADCC和ADCP效应，细胞因子释放，逐渐达到治疗效果。不仅需要观察细胞形态，同时需要监测细胞因子的产生速率以及杀伤效率，传统的检测手段很容易错失最佳检测时机。

Incucyte®可直接安装在细胞培养箱内，对细胞自动连续（数天、数周或数月）拍照获取活细胞的明场和荧光图像，实时观察并全自动分析肿瘤细胞杀伤和免疫细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，即混即读的 96/384 孔检测非常适用于筛选试验，为加速临床前的药物筛选和开发提供了令人兴奋的机会。

-参考文献-

Emily Han-Chung Hsiue#1,2,3, Katharine M. Wright#2,4,5, Jacqueline Douglass#1,2,3, Michael S. Hwang. Targeting a neoantigen derived from a common TP53 mutation. Science. 2021 March 05; 371(6533): . doi:10.1126/science.abc8697.