活细胞分析在免疫学中的十大应用
德国赛多利斯集团
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前言
体外分子水平的研究要结合细胞学的体内研究，才能得到更全面更真实的认识。尤其是免疫学研究中的细胞实验，包括细胞形态，细胞功能，细胞间的相互作用等，更是被越发看重。传统的方法，比如某个时间点对细胞固定染色通过显微镜拍照的方式观察细胞的变化情况，或是用流式、ELISA、PCR等终点法实验对细胞的免疫反应进行检测，这些方法都难以在活细胞状态下进行长时间监测和分析。
如果能够通过实时动力学反映出活细胞的状态随时间的变化，岂不是更好？
赛多利斯Incucyte®实时活细胞分析系统，可以将设备置于培养箱中，不需要拿出培养箱观察，即可对活细胞的行为进行实时、动态、连续地监测，可长达数周，既可得到生长曲线/IC50/EC50，又可生成图片及视频。非常适合免疫学研究中的细胞学实验。
免疫学研究中十大细胞实验：
- 基础研究：细胞增殖、免疫分型、免疫细胞激活与分化、细胞健康与凋亡等
- 细胞功能：免疫细胞杀伤、吞噬与清除作用、NETosis等
- 药效评价：趋化/迁移、抗体内化、病毒感染等
Incucyte®实时活细胞分析系统为以上应用与分析提供更高效、更便捷的方案。
01 细胞增殖及计数
相比传统“终点法“，Incucyte®利用实时活细胞分析更高效地得到细胞增殖及计数结果（表1），并提供灵活、便捷的实验方案（图1）。既可以直接进行无标记的细胞汇合度分析，又可通过专业的Incucyte® Cell-by-Cell Analysis软件进行无标记的细胞计数。通过面积尺寸、形状及荧光强度等指标在单个细胞水平上对视野中的所有细胞进行自动分析和计算，得到生长曲线等数据结果。
表1. 终点法细胞增殖测定 vs 实时活细胞技术细胞增殖测定
02 细胞鉴定和免疫分型
荧光标记的CD抗体（Abs）被广泛用于流式细胞术进行细胞识别和免疫分型，至少有15种人类T细胞亚型被描述出来（例如，CD4+，CD8+等）。Incucyte®利用相同的原理，对标记方法进行改进：
将抗CD抗体结合到同型匹配的带有荧光标签的Fc区域靶向Fab片段，便可通过简单的一步混合来完成标记。在检测中使用一种非干扰性的背景荧光抑制染料，以改善488 nm的荧光信号，保护细胞的同时提供更灵活的分析方案。
03 细胞激活和分化
免疫细胞的分化和激活是免疫力和免疫应答的关键步骤。细胞通过受体信号传导进行扩增并产生功能效应，最终导致基因表达、分化和表型变化。Incucyte®能够更清晰、更深入地研究这个过程的复杂性和动态性：
a. 通过无标记或荧光标记，对免疫细胞活化的形态变化进行实时监测；
b. 使用cell-by-cell软件模块对细胞的图像分割，进行细胞分类；
c. 使用Cytolight Rapid试剂监测活化T细胞聚团
04 细胞健康和凋亡
细胞健康和细胞凋亡的测量对于研究药物、培养条件或基因改造对细胞生长或活力的影响至关重要。 Incucyte®通过使用专为活细胞分析而优化的荧光染料，提供了一种非干扰的、“即混即读”分析方式对细胞凋亡、细胞死亡的时间过程以及它们与细胞增殖的关系的洞察。
Caspase 3/7染料在存在活性caspase的作用下发出荧光，可检测长期和短期效应；Annexin V染料与细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸结合检测早期凋亡，细胞非通透性的DNA结合荧光探针则可用于检测细胞膜的完整性。该方法适用于贴壁细胞及非贴壁细胞，并且，无需将细胞从培养箱中取出即可分析细胞健康和活力，保护细胞、节约时间、提高质量。
05 免疫细胞杀伤（细胞溶解）
细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）、自然杀伤细胞（NK）和某些中性粒细胞能够杀死被感染的或恶性细胞。对于细胞杀伤的检测，可通过检测垂死的目标细胞中的释放的Cr-51和细胞酶（如LDH）等来实现。但这些传统方法存在诸多弊端，例如放射性。而检测技术的关键挑战在于：
(1) 高背景信号；
(2) 难以辨别可能来自效应（杀伤）细胞的污染信号；
(3) 如何判定并测量杀伤终点。
Incucyte®巧妙解决了以上难题。无需取出细胞、无需同位素或抗体标记，免清洗。利用实时、连续的成像方式捕捉细胞随时间的变化信息。其中最简单的是可以用荧光蛋白（如RFP）标记目标细胞，当它们被裂解时，监测荧光的损失。另外也可直接采用annexin V或caspase 3/7测量目标细胞的凋亡。这些方法对于表征检查点抑制剂、CAR-T细胞、双特异性抗体和其他基于免疫的疗法的表型效应非常有用。
06 吞噬作用和细胞清除
吞噬作用是一种特殊形式的细胞内吞作用，可将微生物病原体和外来的、垂死的细胞灭活并从体内清除。评估吞噬作用的常用方法通常为单点分析（例如高内涵分析），需要细胞分离（例如流式细胞术）或清洗/淬灭标记病原体（例如荧光素标记）。
Incucyte®则大大简化了分析流程。使用pH值敏感染料（如pHrodo®）标记活细胞，使该标签与细菌壁蛋白或目标细胞连接。当蛋白或目标细胞被吞噬并进入吞噬体的酸性环境时，可以测量染料荧光随时间的增强。这种方法能够区分吞噬作用和非特异性的细胞吸收或表面结合的非内化标签，提高检测准确性。
07 NETosis
NETosis是一种独特的细胞程序性死亡的形式，也是机体防御感染机制之一。当中性粒细胞遇到入侵的病原体时，它们会释放出一种抗菌蛋白和染色质的混合物来捕获和降解微生物。
Incucyte®可结合 Incucyte® Cytotox 绿色试剂实时自动定量分析执行 NETosis 过程的中性粒细胞的膨胀和解聚阶段，以及之后的 NET 释放过程。实时数据分析也有助于确定补充生化分析的最佳时间点，如NETs中细胞外骨髓氧化酶（MPO）的存在（Gupta, et al., 2017）。此文章总结说，活细胞分析是 "评估中性粒细胞生理学和NETosis、以及迅速开发和测试新的中性粒细胞靶标的有力工具"。
08 趋化作用
趋化作用是细胞在化学刺激下的定向运动，是免疫反应的一个重要组成部分。中性粒细胞、单核细胞、T细胞、巨噬细胞和小胶质细胞都会以这种方式被吸引到病原体和炎症刺激物上。Incucyte® Clearview 96孔趋化板每个孔中都有精确的激光钻孔供细胞移动通过。与传统的Boyden Chamber实验不同的是，当细胞向化学试剂移动时，可以对其进行可视化，量化动力学，能够更深入地洞察细胞随时间的全部生理特征和形态变化。另一个好处是，仅需传统方法1/5~1/10的细胞数量，且重复性更好。
09 病毒感染
在体外测量病毒在哺乳动物细胞中的感染性和复制能力对于我们了解病毒感染疾病、筛选新的抗病毒药物和疫苗以及免疫细胞佐剂至关重要。与传统的蚀斑实验和病灶形成实验相比，Incucyte®可以通过计算被荧光蛋白（如GFP）标记的病毒的细胞数量和程度来自动量化病毒的传播和复制能力，同时还可以评估病毒滴度。此外，HD图像和实时拍摄还提供了病毒侵染后的细胞凋亡或坏死等相关数据。
Incucyte®活细胞分析工作流程的一个有趣的优点是，当添加病毒或病毒复制体到细胞后，培养板不需要离开培养箱。因此，即使是高度传染性的病毒也可以在适当的生物隔离设施中安全地进行分析，而不会使操作者暴露在潜在的危险中。
10 抗体内化
单克隆抗体（mAb）和抗体偶联药物（ADCs）被广泛用于靶向免疫细胞，特别是在肿瘤免疫学和自身免疫性疾病中。这些生物制剂的一个关键特性是内化到不同细胞中的程度和速度决定了它们的疗效、安全性和药效曲线。
传统方法先对每种抗体进行费时费力的标记，过程中需要洗涤步骤，且只能进行单一时间点的分析。整个操作过程繁杂、细胞易损失、数据遗漏。因此，在整个抗体筛选和功能表征过程中，迫切需要一种高效简便的方法，在活细胞状态下进行实时分析快速地定量抗体内化水平。
Incucyte®可以直接在96孔板中检测Ab内化。使用对pH值敏感的荧光染料（Incucyte® Fabfluor-pH）直接与Ab的Fc段结合，即可检测Ab进入细胞内随酸性条件的增强，荧光信号增反映其内化的过程。只需一步添加染料，无需洗涤，即可实现抗体内化的快速、动力学、高通量分析。同一表面蛋白的不同Abs具有不同的内化特征，通过实时活细胞分析可在生物药筛选和优化的关键步骤中，准确且高效地比较不同的抗体候选药物及生产批次的内化率。
Incucyte®实时活细胞分析系统具有以下优势：
- 培养箱内可长达数周的连续观察
- 最多5个荧光通道，多通道检测
- 6个板位，分别独立设置检测程序
- 高效简便的模块化软件设置和数据分析
- 输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数
- 16TB存储，48G内存，12核处理器的大数据分析能力
> 100种优化过的荧光试剂和耗材及详尽的protocols
体外分子水平的研究要结合细胞学的体内研究，才能得到更全面更真实的认识。尤其是免疫学研究中的细胞实验，包括细胞形态，细胞功能，细胞间的相互作用等，更是被越发看重。传统的方法，比如某个时间点对细胞固定染色通过显微镜拍照的方式观察细胞的变化情况，或是用流式、ELISA、PCR等终点法实验对细胞的免疫反应进行检测，这些方法都难以在活细胞状态下进行长时间监测和分析。
如果能够通过实时动力学反映出活细胞的状态随时间的变化，岂不是更好？
赛多利斯Incucyte®实时活细胞分析系统，可以将设备置于培养箱中，不需要拿出培养箱观察，即可对活细胞的行为进行实时、动态、连续地监测，可长达数周，既可得到生长曲线/IC50/EC50，又可生成图片及视频。非常适合免疫学研究中的细胞学实验。
免疫学研究中十大细胞实验：
- 基础研究：细胞增殖、免疫分型、免疫细胞激活与分化、细胞健康与凋亡等
- 细胞功能：免疫细胞杀伤、吞噬与清除作用、NETosis等
- 药效评价：趋化/迁移、抗体内化、病毒感染等
Incucyte®实时活细胞分析系统为以上应用与分析提供更高效、更便捷的方案。
应用案例分享
01 细胞增殖及计数
相比传统“终点法“，Incucyte®利用实时活细胞分析更高效地得到细胞增殖及计数结果（表1），并提供灵活、便捷的实验方案（图1）。既可以直接进行无标记的细胞汇合度分析，又可通过专业的Incucyte® Cell-by-Cell Analysis软件进行无标记的细胞计数。通过面积尺寸、形状及荧光强度等指标在单个细胞水平上对视野中的所有细胞进行自动分析和计算，得到生长曲线等数据结果。
| 终点法 | 实时活细胞技术 |
| 工作量及时间跨度大：24小时测定一次，每次实验需要接种四块板 | 置于培养箱中进行长时间监测，通量高（可同时监测6块孔板） |
| 误差较大，重复性较差，无法保证每个板或孔接种细胞均匀 | 铺板后置入培养箱，无需移动细胞，保证精度和重复性 |
| 需要第三方软件手动分析 | 软件自动识别、分析，自动计算细胞数量、密度结果 |
表1. 终点法细胞增殖测定 vs 实时活细胞技术细胞增殖测定
图1. Incucyte®细胞增殖及计数分析
02 细胞鉴定和免疫分型
荧光标记的CD抗体（Abs）被广泛用于流式细胞术进行细胞识别和免疫分型，至少有15种人类T细胞亚型被描述出来（例如，CD4+，CD8+等）。Incucyte®利用相同的原理，对标记方法进行改进：
将抗CD抗体结合到同型匹配的带有荧光标签的Fc区域靶向Fab片段，便可通过简单的一步混合来完成标记。在检测中使用一种非干扰性的背景荧光抑制染料，以改善488 nm的荧光信号，保护细胞的同时提供更灵活的分析方案。
03 细胞激活和分化
免疫细胞的分化和激活是免疫力和免疫应答的关键步骤。细胞通过受体信号传导进行扩增并产生功能效应，最终导致基因表达、分化和表型变化。Incucyte®能够更清晰、更深入地研究这个过程的复杂性和动态性：
a. 通过无标记或荧光标记，对免疫细胞活化的形态变化进行实时监测；
b. 使用cell-by-cell软件模块对细胞的图像分割，进行细胞分类；
c. 使用Cytolight Rapid试剂监测活化T细胞聚团
04 细胞健康和凋亡
细胞健康和细胞凋亡的测量对于研究药物、培养条件或基因改造对细胞生长或活力的影响至关重要。 Incucyte®通过使用专为活细胞分析而优化的荧光染料，提供了一种非干扰的、“即混即读”分析方式对细胞凋亡、细胞死亡的时间过程以及它们与细胞增殖的关系的洞察。
Caspase 3/7染料在存在活性caspase的作用下发出荧光，可检测长期和短期效应；Annexin V染料与细胞膜外侧的磷脂酰丝氨酸结合检测早期凋亡，细胞非通透性的DNA结合荧光探针则可用于检测细胞膜的完整性。该方法适用于贴壁细胞及非贴壁细胞，并且，无需将细胞从培养箱中取出即可分析细胞健康和活力，保护细胞、节约时间、提高质量。
05 免疫细胞杀伤（细胞溶解）
细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）、自然杀伤细胞（NK）和某些中性粒细胞能够杀死被感染的或恶性细胞。对于细胞杀伤的检测，可通过检测垂死的目标细胞中的释放的Cr-51和细胞酶（如LDH）等来实现。但这些传统方法存在诸多弊端，例如放射性。而检测技术的关键挑战在于：
(1) 高背景信号；
(2) 难以辨别可能来自效应（杀伤）细胞的污染信号；
(3) 如何判定并测量杀伤终点。
Incucyte®巧妙解决了以上难题。无需取出细胞、无需同位素或抗体标记，免清洗。利用实时、连续的成像方式捕捉细胞随时间的变化信息。其中最简单的是可以用荧光蛋白（如RFP）标记目标细胞，当它们被裂解时，监测荧光的损失。另外也可直接采用annexin V或caspase 3/7测量目标细胞的凋亡。这些方法对于表征检查点抑制剂、CAR-T细胞、双特异性抗体和其他基于免疫的疗法的表型效应非常有用。
06 吞噬作用和细胞清除
吞噬作用是一种特殊形式的细胞内吞作用，可将微生物病原体和外来的、垂死的细胞灭活并从体内清除。评估吞噬作用的常用方法通常为单点分析（例如高内涵分析），需要细胞分离（例如流式细胞术）或清洗/淬灭标记病原体（例如荧光素标记）。
Incucyte®则大大简化了分析流程。使用pH值敏感染料（如pHrodo®）标记活细胞，使该标签与细菌壁蛋白或目标细胞连接。当蛋白或目标细胞被吞噬并进入吞噬体的酸性环境时，可以测量染料荧光随时间的增强。这种方法能够区分吞噬作用和非特异性的细胞吸收或表面结合的非内化标签，提高检测准确性。
07 NETosis
NETosis是一种独特的细胞程序性死亡的形式，也是机体防御感染机制之一。当中性粒细胞遇到入侵的病原体时，它们会释放出一种抗菌蛋白和染色质的混合物来捕获和降解微生物。
Incucyte®可结合 Incucyte® Cytotox 绿色试剂实时自动定量分析执行 NETosis 过程的中性粒细胞的膨胀和解聚阶段，以及之后的 NET 释放过程。实时数据分析也有助于确定补充生化分析的最佳时间点，如NETs中细胞外骨髓氧化酶（MPO）的存在（Gupta, et al., 2017）。此文章总结说，活细胞分析是 "评估中性粒细胞生理学和NETosis、以及迅速开发和测试新的中性粒细胞靶标的有力工具"。
08 趋化作用
趋化作用是细胞在化学刺激下的定向运动，是免疫反应的一个重要组成部分。中性粒细胞、单核细胞、T细胞、巨噬细胞和小胶质细胞都会以这种方式被吸引到病原体和炎症刺激物上。Incucyte® Clearview 96孔趋化板每个孔中都有精确的激光钻孔供细胞移动通过。与传统的Boyden Chamber实验不同的是，当细胞向化学试剂移动时，可以对其进行可视化，量化动力学，能够更深入地洞察细胞随时间的全部生理特征和形态变化。另一个好处是，仅需传统方法1/5~1/10的细胞数量，且重复性更好。
09 病毒感染
在体外测量病毒在哺乳动物细胞中的感染性和复制能力对于我们了解病毒感染疾病、筛选新的抗病毒药物和疫苗以及免疫细胞佐剂至关重要。与传统的蚀斑实验和病灶形成实验相比，Incucyte®可以通过计算被荧光蛋白（如GFP）标记的病毒的细胞数量和程度来自动量化病毒的传播和复制能力，同时还可以评估病毒滴度。此外，HD图像和实时拍摄还提供了病毒侵染后的细胞凋亡或坏死等相关数据。
Incucyte®活细胞分析工作流程的一个有趣的优点是，当添加病毒或病毒复制体到细胞后，培养板不需要离开培养箱。因此，即使是高度传染性的病毒也可以在适当的生物隔离设施中安全地进行分析，而不会使操作者暴露在潜在的危险中。
10 抗体内化
单克隆抗体（mAb）和抗体偶联药物（ADCs）被广泛用于靶向免疫细胞，特别是在肿瘤免疫学和自身免疫性疾病中。这些生物制剂的一个关键特性是内化到不同细胞中的程度和速度决定了它们的疗效、安全性和药效曲线。
传统方法先对每种抗体进行费时费力的标记，过程中需要洗涤步骤，且只能进行单一时间点的分析。整个操作过程繁杂、细胞易损失、数据遗漏。因此，在整个抗体筛选和功能表征过程中，迫切需要一种高效简便的方法，在活细胞状态下进行实时分析快速地定量抗体内化水平。
Incucyte®可以直接在96孔板中检测Ab内化。使用对pH值敏感的荧光染料（Incucyte® Fabfluor-pH）直接与Ab的Fc段结合，即可检测Ab进入细胞内随酸性条件的增强，荧光信号增反映其内化的过程。只需一步添加染料，无需洗涤，即可实现抗体内化的快速、动力学、高通量分析。同一表面蛋白的不同Abs具有不同的内化特征，通过实时活细胞分析可在生物药筛选和优化的关键步骤中，准确且高效地比较不同的抗体候选药物及生产批次的内化率。
- 培养箱内可长达数周的连续观察
- 最多5个荧光通道，多通道检测
- 6个板位，分别独立设置检测程序
- 高效简便的模块化软件设置和数据分析
- 输出图片、视频、生长曲线等多指标多参数
- 16TB存储，48G内存，12核处理器的大数据分析能力
> 100种优化过的荧光试剂和耗材及详尽的protocols
