细胞膜染料+外泌体染料双染策略，彻底解决外泌体摄取实验中的假阳性问题

外泌体的细胞摄取实验中有两个难以回避的问题：

1）聚集造成的假阳性：常规亲脂性染料在水溶液中自发形成染料聚集体或团块，难以吹散，聚集染料的荧光信号极易与外泌体混淆，引起观测结果的假阳性；

2）二次标记造成的假阳性：由于外泌体膜与细胞膜结构的相似性，常规染料标记的外泌体在被细胞摄取后一旦脱落，会二次标记细胞膜带来非外泌体荧光信号。

那有什么染色方法可以完美解决上述的两个难题呢？

基于 FilmCLICK Tech. 技术开发的 EvLINK 具有极高的特异性和高于 99% 的标记率，且一旦 EvLINK 从外泌体表面脱落，其活性基团即刻变性失活，掉落的EvLINK 仅发出无法被检测的微弱荧光，不再对膜结构二次标记，避免染料二次标记带来的假阳性。Fig.1 分别为 EvLINK 对外泌体的标记率及化学模拟 EvLINK 活性基团变性后对外泌体的标记率：

Fig.1 （a）EvLINK 505 对外泌体的标记率与（b）化学模拟脱落的的EvLINK 505 结构对外泌体的标记率

EvLINK 通过共价偶联外泌体膜而实现标记发光，避免了两大“假阳性”：

1）非亲脂性染料，无聚集趋势，避免了因染料聚集带来的假阳性；

2）不弥散，仅标记外泌体膜轮廓，不标记细胞膜，避免了染料弥散二次着色细胞膜带来的假阳性。Fig.2 为弥散性亲脂染料 DIO 标记的外泌体与非弥散性 EvLINK 505 标记的外泌体被 U251 细胞摄取结果对比，可以看到明显的 DIO 弥散标记细胞膜的痕迹。

Fig.2 弥散性亲脂染料 DIO 标记的外泌体（a）与非弥散性 EvLINK 505 标记的外泌体（b）被 U251 细胞摄取

EvLINK 被广泛应用于各种动植物细胞来源的外泌体的体内外示踪剂，对外泌体的形态学及其生物学功能的影响微乎其微。我们对 EvLINK 标记后的外泌体进行 TEM、nanoFCM 和 Western blot 表征（Fig.3），发现：

1）标记后的外泌体在透射电镜下仍然保持标志性的外泌体茶托状结构；

2）标记后外泌体平均粒径分布差异不明显，仅增加~5 nm，这是大量 EvLINK 均匀的负载在外泌体表面的结果；

3）Western blot 显示标记前后蛋白的条带位置不变，说明 EvLINK 不会标记外泌体表面蛋白。

Fig.3 被 EvLINK （a）标记后和（b）标记前的外泌体的TEM图像；被 EvLINK （c）标记后和（d）标记前外泌体的粒径分析（nanoFCM）;（e）EvLINK 标记前后的外泌体 Western blot：左为标记前的外泌体，右为经 EvLINK 标记后的外泌体。

基于 FilmCLICK Tech.技术开发的 CellLINK 系列染料具有同样的膜标记特点，可以清晰的展现细胞膜轮廓，与 EvLINK 结合可以完美实现外泌体被细胞摄取实验。Fig.4 为 EvLINK 505 标记的外泌体+CellLINK 标记细胞膜和 PKH-67 标记的外泌体+ F-actin 摄取实验对比，图 Fig.4a 中可以看到 CellLINK 555 标记的清晰的红色膜轮廓，经过 EvLINK 505 标记后的绿色外泌体分散在细胞膜内；Yu 等使用 F-actin 标记细胞膜轮廓，PKH-67 标记外泌体，尽管共聚焦显微镜下观测到的外泌体明亮的绿色荧光，然而该绿色荧光呈弥散状分布，难以较好区分外泌体与细胞膜。

Fig.4 （a）EvLINK 505 标记的外泌体+CellLINK 标记细胞膜和（b）PKH-67 标记的外泌体+F-actin 标记细胞膜摄取实验对比

细心的同学可能注意到了，为什么 merge 中有黄色光点呢？这要从实验操作中探寻黄色光点的身份。有了 EvLINK+CellLINK 绝佳的染料组合，只需两步即可完成外泌体摄取实验：1）首先用EvLINK标记外泌体，去除游离染料后，与细胞共培养，此时细胞吞噬 EvLINK 标记的外泌体；2）使用 CellLINK 标记细胞膜，PBS 洗去游离染料后，共聚焦显微镜下观测即可。

Fig.5 中，红色表示细胞膜，绿色表示外泌体，黄色颗粒状表示被 EvLINK+CellLINK 双染的区域，也就是未完全进入细胞膜的外泌体。

Fig.5 （a）CellLINK 555 （U251 细胞膜）+EvLINK 505（牛奶外泌体）双染外泌体摄取实验（b）CellLINK 555（A549 细胞膜）+EvLINK 505（牛奶外泌体）双染外泌体摄取实验

由于CellLINK 无细胞膜选择性（会标记外泌体）且完全不透过细胞膜，EvLINK+CellLINK 双染策略不仅仅可以看到被细胞摄取的外泌体（绿色），还能清晰分辨出没有完全进入细胞膜的外泌体（黄色）。

基于 FilmCLICK Tech. 开发的 EvLINK 和 CellLINK 由于上述特性，EvLINK+CellLINK 双染技术，可以帮助科学家完美解决外泌体摄取实验中的假阳性问题。