免疫共沉淀
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1. 溶液准备:
RIPA缓冲液:50mM Tris-HCl pH7.4 ,150mM NaCl ,1mM EDTA,1%Triton×100,1%去氧胆酸钠,0.1%SDS,1mM PMSF,1μg/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 ( aprotinin ) , 1μg/ml亮抑蛋白酶肽 ( leupeptin )
PBS ( pH7.4 ) :10mM Na2HPO4,1.8mM KH2PO4 ,50mM NaCl ,2.7mM KCl
1×样品缓冲液:65mM Tris-HCl ( pH8.0 ),10% ( v/v ) 甘油,2.3%(w/v) SDS,0.01% 溴酚蓝,1% DTT
2. 实验程序:
1 ) 用PBS-EDTA或胰蛋白酶水解液收获细胞并计数。
2 ) 按1ml/107个细胞用预冷的RIPA缓冲液来裂解细胞,4℃摇1h。
3 ) 10000g,4℃离心20min,取上清液。
4 ) 用PBS清洗蛋白A/G琼脂糖颗粒两次,用RIPA缓冲液稀释琼脂糖颗粒至浓度为50%。
5 ) 按每50ml颗粒悬浮液需1ml细胞裂解液计算需要裂解液体积,取相应体积数的裂解液在4℃条件下摇10min。10000g,4℃离心10min,将上清转移到新管中。
6 ) 按每5×106 个细胞加0.5ml细胞裂解液,取相应的裂解液到新管中准备免疫共沉淀(IP)反应,每个反应中加入8-15μg抗体,冰上摇3h。
7 ) 加50ml 50%颗粒悬浮液,4℃摇1h。
8 ) 10000g离心15s,弃上清。
9 ) 用1ml RIPA缓冲液洗涤颗粒两次,以除去无特异结合的蛋白,然后用1ml PBS洗涤3次。
10) 60μl样品缓冲液悬浮颗粒,95℃煮沸5min;SDS-PAGE电泳前样品10000g短时离心15s。