转基因定量PCR检测操作步骤

1. 样品制备
20-50 mg食品及标准品研磨成粉，按以下方法抽提DNA：PrepMan Ultra Sample Preparation Reagent (AB, 4318930), DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)

2. SDS检测板设置
Plate类型： Single Reporter, Real Time。
FAM层： 未知样品、标准品、对照均设定为UNKN；不同类型的检测孔可在Sample Name栏以不同名称相互区分。命名请参照以下规则：标准品：1 Maize STD 0%；未知品：Unk #1 Soy。
VIC层： 未知样品、标准品、对照均设定为IPC+。
Passive Reference: ROX。
Quencher: TAMRA。
Replicate: 同一组重复样品给定同样的名称，如“1.0% GM Std”。

3. PCR反应
无论STND和UNKN，每一样品至少重复检测3次。

试剂 用量
DNA (10ng) 5 ul
PCR Mix 44 ul
Taq Gold (5 U/ul) 1 ul
总体积 50 ul

阴性对照和阳性对照分别以5 ul Negative Control或Positive Control代替DNA。
PCR循环条件：94 °C 9 min ® (95 °C 20 sec ® 60 °C 1 min ® 72 °C 30 sec) x 40个循环

4. 数据分析
1. PCR完成后，保存数据；运行Analysis命令；Export Results，Save。也可Export Selected Wells。
2. 在Excel中打开所输出的结果，按Replicate (first) 和Well (second) 分别Sort FAM和VIC数据
3. 增加一列，计算DCT值(= CT FAM - CT VIC)
4. 增加两列，分别计算DCT值的平均值和标准偏差
5. 将标准品的%GM和平均DCT数据转移到另外一个区域，计算Log (%GM)
6. 利用Excel的TREND运算计算各未知样品的%GM
7. 上述计算也可以利用已有的Excel宏自动完成：在Excel Macro“Calculate %GMO”中，粘贴标准品及未知样品的FAM和VIC层的CT值，Excel Macro即自动计算出DCT值(CT FAM - CT VIC)、标准曲线和各UNKN样品的%GM。

5. 主要试剂和器材
1. 4327691 TaqMan GMO Soy Detection kit
2. 4327690 TaqMan GMO Maize Detection kit
3. 由GMO Concentration Reference Standards (Fluka) 制备的标准品DNA，包括0%、0.1%、0.5%、1%、2%、5%等 6种。
4. Microsoft Excel Spreadsheet
5. 96-well plate 离心机