放射性碘标记:酰化试剂(Bolton和Hunter试剂)法
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1.原理这个方法用酰化剂3--(4-羟苯基)丙酸—N琥珀酰胺酯(Bolton—Hunter
试剂
)做连接
试剂
,将
125
I标记在羟苯基的2,5位置上,再将琥珀酰胺酯水解,通过一个酰氨键将3--(4—羟基—5—
125
I—苯基)接在蛋白或多肽的末端氨基上。
2.方法 125 I—Bolton—Hunter试剂可用氯胺T法自行制备,出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯(μmol 蛋白用3~5μmol标记酯),用氮气吹除苯,投入欲标记蛋白5~10μg及缓冲液10~50μl,pH8.0~8.5为宜,在冰浴中反应15~30min后,加入多量 氨基酸 (如甘氨酸),使过量标记酯消耗掉以终止反应。
此法避免了蛋白质与氧化剂的接触,又避免了与放射性碘原子的直接接触,可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤,适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心,引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂,需要接触较多的放射性,经二步反应,碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽,而适于分子量大于1万的蛋白质。
2.方法 125 I—Bolton—Hunter试剂可用氯胺T法自行制备,出已有该试剂的苯溶液作为商品出售。使用时取一定量的标记酯(μmol 蛋白用3~5μmol标记酯),用氮气吹除苯,投入欲标记蛋白5~10μg及缓冲液10~50μl,pH8.0~8.5为宜,在冰浴中反应15~30min后,加入多量 氨基酸 (如甘氨酸),使过量标记酯消耗掉以终止反应。
此法避免了蛋白质与氧化剂的接触,又避免了与放射性碘原子的直接接触,可防止碘源中有害物质对蛋白质的损伤,适用于标记缺乏酪氨酸的蛋白质或酪氨酸在活性中心,引入碘原子后会引起蛋白质的失活。其缺点是标记技术比较复杂,需要接触较多的放射性,经二步反应,碘标记率比较低。一般认为此法不宜标记短肽,而适于分子量大于1万的蛋白质。