大肠杆菌感受态的制备及重组DNA的转化

1．感受态的制备

（1）接种单菌落于2ml LB培养液中，37℃过夜。

（2）取0.25ml过夜菌入25ml LB培养液中，37℃振摇4～6h至A590=0.4～0.6。

（3）倒入50ml管内，水浴10min，以2500～3000rpm离心5min，弃上清。

（4）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl₂5ml悬浮菌体，冰浴20min，同上离心弃上清。

（5）缓慢加入75mmol/L预冷CaCl₂1.0ml轻轻混匀后分装在1.5ml Eppendorf管中，每管200μl，冰浴1～2h。

2．重组DNA的转化

（1）将3只Eppendorf管按下列转化项目作好标记：

（2）冰浴30min至1h。中间摇动3次，以防受体菌沉底。

（3）42℃90s。

（4）37℃水浴5min。

（5）加入无相应抗生素的Lb 200μl，混匀后，37℃水浴30～60min。

（6）分别取3组反应物各50μl在含相应抗生素的固体LB培养基平皿上涂布，室温下干燥，然后倒置于37℃温箱中培养过夜。