显微镜的技术发展及不同显微镜对比
Evident
光学显微镜
三百多年前，人类已经使用光学显微镜观察肉眼无法分辨的微观物体。1662 年，英国物理学家罗伯特·胡克使用自制的显微镜观察软木切片，发现其在放大后呈现出类似修道院单人居室的微观结构-细胞。这是人类历史上第一次观察到细胞。
3 年后，胡克出版了首部关于显微镜的著作——《显微图谱》，书中包含大量绘制精美的动、植物机体微观结构图像，开创了科学界利用图画方式进行交流的先河。《显微图谱》的出版使人们意识到微观世界和宏观世界一样丰富多彩，其中有许多未知的奥秘等待着被探索。同一时期，荷兰商人列文虎克（Antoni van Leeuwenhoek，1632—1723 年）制造出当时“最强”的光学显微镜，可实现 300 倍放大率，并持续「称霸」一个多世纪。
1676 年春天，列文虎克用显微镜观察雨水发现水中有很多在活动的小生命，并给英国皇家学会寄去了包含这些发现的信件，其中有这样一段话：「我判断，即使把一百个这些小动物撑开摆在一起，也不会超过一颗粗沙子的长度；如果这是真的，那么一百万个这些活物也不够一颗粗沙粒的体积这」。段文字中的「小动物」，就是我们现在熟知的细菌。这是人类首次发现活体细菌，由此开创了微生物学，为人类对生物学和显微镜的研究开启了一个新时代。
随后，光学显微技术经历了不断的革新，以越来越高的分辨率与成像质量，引导人类向无尽的微观世界发起无穷的探索。特别是上世纪以来，随着人类对生命现象本质研究的逐渐深入，生命科学涉及问题的日益深化，检验医学对快速准确检测手段需求的不断提高，光学显微技术得到了突飞猛进的发展。
超分辨荧光显微成像技术
1873 年，德国物理学家恩斯特·阿贝提出了光学成像系统的衍射极限理论，指出光学显微镜的分辨率极限大约是可见光波长的一半（约 200nm），这被称为「阿贝极限」1,2。该问题困扰着科学家长达一个世纪之久，彼时光学显微镜的应用一直被限制在细胞水平而无法在亚细胞层面进行高分辨成像。
21 世纪初，受激发射损耗显微术（stimulated emission depletion，STED）、结构光照明显微术（structured illumination microscopy，SIM）、单分子定位显微术（photoactivated localization microscopy/stochastic optical reconstruction microscopy，PALM/STORM）等超分辨成像技术，打破了百余年来似乎一直被认为是无法突破的阿贝衍射极限。在纳米尺度至单分子水平可视化生物分子，以前所未有的时空分辨率探究活细胞结构和动态过程，成为生命科学研究中不可或缺的重要工具。
单分子定位的显微术
基于单分子定位的超分辨显微成像，2014 年诺贝尔奖得主之一Betzig 提出 PALM 技术，该技术基于荧光分子的光转化能力和单分子定位，通过用光控制每次仅有少量随机离散的单个荧光分子发光，并准确定位单个荧光分子点扩散函数的中心，最终利用多次曝光叠加成一幅超高分辨率图像。
之后，Hess 提出的荧光活化定位显微术（fluorescence photoactivation localization microscopy, fPALM）与 PLAM 原理相似，荧光团经探测器成像后，由光强控制荧光分子被可逆地灭活或不可逆地光漂白而从视场中消失。
由 Zhuang 等提出的 STORM 技术与 PALM 技术在原理上类似，其利用化学小分子 Cy3 和 Cy5、Cy7 等荧光分子对的光转换效应同样可以达到突破光学极限的效果。与PALM区别在于其所利用的探针是化学小分子而不是生物大分子。因此，STORM 需要利用荧光发色团标记抗体对靶蛋白进行识别，可以检测到内源性蛋白，避免 PALM 中由于外源性表达偶联荧光蛋白的靶蛋白对其定位产生的可能的影响。
受激发射损耗显微术
STED 是一种基于点扩散函数调制的超分辨技术，最早由 2014 年诺贝尔奖得主之一 Hell 提出。STED 采用两束共轴激光，分别为激发光和损耗光。在激发光的照射下，基态的荧光分子吸收光子跃迁到激发态并发射出荧光；再使用环形损耗光将第 1 束光斑周围的荧光物质通过受激损耗过程灭活，只保留位于中间部位的纳米尺度区域以减少荧光光点的衍射面积，通过扫描记录即可获取整个样品的完整图像。STED 显微镜的横向分辨率可达 20~70nm，凭借超高的分辨率，STED 很快被应用于生物细胞研究并取得一系列重要的新发现。
但是，由于 STED 本身属于点扫描成像技术，为了提升成像速度，STED 通常需要高的激发强度（~107W/cm2）来记录足够的光子以换取时间分辨率，所导致的光毒性和光漂白限制了 STED 在活细胞成像中的应用。
结构光照明显微术
另一种典型的基于点扩散函数调制的超分辨技术是 SIM 技术。成像系统的分辨率受到阿贝衍射极限的限制，存在接近波长一半尺度的衍射极限，物场信息中高于此光学传递函数截止频率的成分将会被滤除。针对这一问题，Gustafsson 于 2000 年提出了 SIM 技术，其基本原理是通过结构化照明在频域以空间混频的方式将物体高频信息载入光学系统的探测通带内实现突破阿贝衍射极限的超分辨光学显微成像。当利用周期性结构正弦照明光激发样品时，在频域上由于结构光频谱与物频谱的卷积而产生携带物体信息的多级频谱。其中±1 级频谱将携带物体细节信息的高频部分平移至截止频率范围内而被探测，如图1所示。但这些高频信息与0级频谱的低频信息叠加在一起，需要后期数据处理（如相移、反卷积、参数估计等）将三级频谱分开才能有效获得样品的高频信息。
图 1 SIM的超分辨原理示意图及超分辨结果。(a) 线性结构光照明显微术的光路及频谱调制过程。(b) 饱和结构光照明显微技术的频谱调制过程。(c) COS-7 细胞中 f-肌动蛋白的饱和 SIM 超分辨图像及不同方法的对比结果（左上：宽场，右上：反卷积，左下：SIM，右下：SSIM）。(d) 不同方法下 COS-7 细胞中质膜微囊的超分辨图像（左上：宽场，右上：反卷积，左下：SIM，右下：SSIM）。(e) 活体 COS-7 细胞中质膜微囊的SSIM超分辨结果 18,21,22
由于结构光条纹照射在样品上也受到系统衍射限制，因此等效截止频率最多可拓展一倍，即 SIM 的分辨率最多能在衍射极限基础上提高一倍，达到非相干衍射极限的 2 倍，约在 100nm。
尽管 SIM 对横向分辨率的提升不如 PALM、STORM、STED 等技术，但其高的光子效率、较快的成像速度和全场成像等优点使得其非常适合进行活细胞的超分辨成像。值得注意的是，光栅衍射效应不仅仅限于 ±1 级频谱，例如矩形光栅的频谱就要丰富得多，其还包括 ±2 级、±3 级等高阶频谱。
因此，假如能采用矩形光栅作为结构光，则可以产生多级频谱，使等效截止频率得到多次拓展从而大幅提高分辨率。但由于结构光的产生也受到光学系统有限孔径的限制，直接在物平面上形成一个周期接近衍射极限分辨率的矩形光栅并不现实。针对此问题，Gustafsson 在传统 SIM 的基础上进一步提出了饱和结构光照明显微技术（saturated SIM，SSIM），巧妙地利用荧光分子的饱和激发使样品在正弦光波激发下发出具有高阶频率分量的非正弦结构光，从而实现多级频谱拓展[如图7(b)]，将分辨率提高到了约50nm的水平。然而饱和照明所需的高强度激光增加了 SSIM 的光毒性与光漂白，无法发挥 SIM 高光子效率、低光损伤的优势，使其难以运用于活细胞成像，因此并未得到广泛应用。
实时活细胞超分辨显微成像
SIM 具有宽视场、快速成像、光漂白和光毒性弱以及对荧光染料的非特异性需求等独特优势，因此特别适合于活细胞的长时程超分辨成像。尽管有着诸多优势，SIM 仍然受到一些技术上的挑战，其高质量超分辨图像的数值重建很大程度上依赖于对照明参数的精确估计，这些参数的微小误差会对重建结果产生重大影响，导致干扰定量的重建伪影。此外，“变化多端”的照明参数对实验环境极为敏感，除非严格保持成像条件稳定，否则需要在每帧超分辨图像重建前从获取的原始观测数据中进行逐帧的照明参数提取。目前最广泛使用的基于迭代互相关的参数估计法通过实空间相位梯度形式的亚像素优化提取高精度的照明参数（波矢、初相位、调制度）。
然而，COR 的性能受到维持活细胞长期成像所需的低光漂白和光毒性的严苛成像条件所导致的低信噪比的影响，且复杂耗时的迭代优化过程大大降低了SIM的图像重建效率，对快速、实时、长时程、无伪影的活细胞动态超分辨成像构成了严峻挑战。
南京理工大学的陈钱、左超教授课题组提出一种高效、鲁棒的结构光照明显微技术（PCA-SIM），实现了在有外界干扰的复杂、低信噪比实验环境下对照明参数的快速自适应精准补偿和对活细胞精细结构的实时、高质量动态超分辨成像。
然而，由于噪声、光学像差、样品非均匀调制度等干扰因素，通常情况下实验上所获得的相量矩阵会存在不规则的高维分量。如何消除这些高维干扰分量以获得对应理想照明相量矩阵中单一“主成分”，将是低信噪比条件下进行 SIM 准确参数估计的关键。
主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）是最重要的数据降维方法之一，其利用正交变换把由线性相关变量表示的原始数据转换到少数几个由线性无关变量表示的低维度子空间上，称为主成分。这恰恰与前面所述的从相量矩阵中准确估计照明参数所要完成的任务不谋而合。因此，研究人员利用 PCA 的“降维”特性，将实验采集到的照明相量矩阵中的干扰成分剔除，以提取由照明参数主导的“第一主成分”，从根本上消除了影响照明参数精确估计的干扰项，从而以简单高效的方式精准识别亚像素精度的波矢量与初相位。
研究人员进一步发现，理想照明相量矩阵的离散傅里叶逆变换本质上是一个中心能量集中的狄利克雷（Dirichlet）函数。这种信号的高度局域化启发研究人员在频谱域中引入一种双窗掩膜算子，在进一步抑制噪声干扰的同时，将 PCA 的运算量减少约两到三个量级，极大改善了照明参数估计的计算效率、准确性和稳定性。高精度、非迭代重建、鲁棒的抗噪性和较低的运算量使 PCA-SIM 为快速、长时程、无伪影的活细胞超分辨成像开辟了一条新途径。
研究者基于 PCA-SIM 实现了对活体 COS-7 细胞线粒体的实时超分辨成像，依靠的平台是基于奥林巴斯 IX73 倒置荧光显微镜自主搭建的三色干涉式 SIM 超分辨仪器（图 2）。
图 2 研究人员基于奥林巴斯 IX73 倒置荧光显微镜自主搭建的三色干涉式 SIM 超分辨仪器示意图。激发光通过一系列二向色镜与反射镜由空间滤波器扩束准直，照射在显示高频光栅图像的空间光调制器上并发生衍射，±1级衍射光通过显微物镜在样品表面发生干涉，激发出的荧光通过物镜与二向色镜被相机接收。
