实验1 显微镜

实验1 显微镜

　　

　　一、目的

　　了解显微镜的基本构造，初步掌握显微镜的使用方法。

　　二、内容

　　（一）观察显微镜的各部分结构，理解其基本性能。

　　（二）通过字母片和粉蝶鳞片的观察，学习使用显微镜的方法。

　　（三）初步认识几种类型的显微镜。

　　三、实验材料和用具

　　学生用显微镜、几种不同类型的显微镜。

　　载玻片、盖玻片、字母片、50％酒精、粉蝶、毛笔。

　　显微镜是观察研究细胞、组织以及原生动物等必需的仪器，由于显微镜的发展日新月异，而我国各高校教学实验室的设备水平不等，因此我们在此仍以简单的单筒目镜和双筒目镜复式显微镜为主，再辅以标准的实验室显微镜。

　　四、实验操作及观察

　　必须按实验指导了解显微镜的各部分结构、性能及使用方法。切不可脱离实验指导，擅自扭动各部件，以免损坏仪器。

　　使用显微镜作一般观察主要是学会调亮度、调焦点。作显微照相时，还必须调中心（调聚光器中心）。

　　使用高倍镜时，一定要从低倍镜开始。用油镜时要从40×的物镜开始。将要观察的标本某部分移至视野正中央。在高倍镜下只能用细调焦器调焦点，不能用粗调焦器。要开大光阑。

　　（一）显微镜的基本结构：显微镜的中部有一弯曲的柄，称镜臂，基部为镜座。用右手握紧镜臂，将其自镜箱（或镜柜）中取出，左手托住镜座，保持镜体直立，轻放于桌上，观察各部分构造。

　　镜座上的短柱叫镜柱。镜座与镜柱之间有一倾斜关节（在较新的显微镜无此倾斜关节），可使显微镜在90°角范围内随意倾斜成任何角度。

　　在镜臂基部有一个方形或圆形的平台，是载物台（或称镜台）。台的中央有一圆孔，可通过光线。两侧有压片夹，用以固定玻片标本。现代的显微镜具镜台X－Y驱动器，用以固定和移动玻片标本。在圆孔的下面，有由一片或数片透镜所组成的聚光器，有集射光线于物体的作用。聚光器附有一组由金属片组成的可变光阑，其侧面伸出一杠杆，可前后移动使光阑开闭。光阑开大则光线较强，适于观察色深的物体；光阑缩小则光线较弱，适于观察透明（或无色）的物体。

　　在聚光器下方有反光镜，可将光线反射至聚光器。此镜一面平，一面凹。凹面具有较强的反光性，多用于光线较暗的情况下；光线较强时用平面镜即可。内光源显微镜的光源位于镜座靠后方，在镜座右侧有光源按钮，此按钮可前后移动，使光阑开闭，用以调节光线的强弱。

　　在载物台的圆孔上方，有一附于镜柄上端的圆筒称为镜筒，其上下两端附有镜头。显微镜如具有抽筒，则在观察物体之前，一般应抽至160mm处。现代的显微镜一般有两个镜筒。两镜筒之间的距离，可按观察者双目的距离调节。

　　镜筒上端有接目镜（或称目镜），可从镜筒内抽出。接目镜有低倍和高倍之分。

　　在镜筒下端有可旋转的圆盘叫旋转器，下面附有2～4个接物镜（或称物镜）以螺旋旋入旋转器内。接物镜也有低倍和高倍之分。转动旋转器可换用接物镜。

　　在镜臂上有两组螺旋。大的叫粗调焦器，小的叫细调焦器。现代的显微镜粗、细调焦器常组合在一起，外周粗的螺旋为粗调焦器，中央细的为细调焦器。用调焦器调焦点。粗调焦器升降镜筒较快，用于低倍镜调焦；细调焦器升降镜筒较慢，用于高倍镜调焦。

　　接物镜有低倍和高倍之分。较短的是低倍，一般放大10倍（10×）；较长的是高倍，一般放大40倍（40×）、45倍（45×）或60倍（60×）。油物镜放大90倍（90×）或者100倍（100×）。接目镜也有高低倍之分，较长的是低倍，一般放大5倍（5×）或6倍（6×），较短的是高倍，一般放大10倍（10×）、12倍（12×）或15倍（15×）。

　　显微镜的总放大倍数是接目镜的放大倍数与接物镜放大倍数的乘积。例如，使用5×接目镜与10×接物镜，则总放大倍数是50倍。使用10×接目镜与40×接物镜，则总放大倍数是

　　（二）显微镜的使用方法：使镜臂向着自己（现代显微镜使镜臂反向对着自己），摆好显微镜。转动粗调焦器，把镜筒向上提起。转动旋转器，使低倍接物镜对准载物台的圆孔。二者相距约2cm左右，两眼对着双筒接目镜观察（如为单筒目镜，则两眼睁开，用左眼看）。打开可变光阑，用手转动反光镜，使它正对着光源，但不可对直射的阳光。当视野（即从镜内看到的圆形部分）呈现一片均匀的白色时即可。如为内光源显微镜，打开光源按钮，向前向后移动按钮，调节光线的强弱至适宜强度。

　　取一拉丁字母装片放载物台上，使字母正对中央圆孔。用压片夹（或X－Y驱动器）固定。转动粗调焦器，使镜筒下降至低倍接物镜距装片5mm左右为度。然后自目镜观察，同时转动粗调焦器，提升镜筒，至视野内的字母清晰为止，此为调焦点。再以可变光阑调节亮度至适宜强度。一般现代显微镜由粗、细调焦器提高或降低镜台一镜台下聚光器。

　　注意视野内看到的字母，上下左右轻轻移动装片，物像的移动方向如何？思考一下原因。

　　低倍物镜观察毕可转高倍物镜。首先将要详细看的部分移到视野正中央，提升镜筒，转动旋转盘，换高倍物镜。从侧面观察下降镜筒，使高倍物镜几乎接触玻片（1mm左右）为止。再从目镜观察，转动细调焦器，提升镜筒，一般旋转半圈至一圈即可出现物像（要小心操作，切勿压破盖玻片或载玻片）。可将光阑开大，上下调节细调焦器，使物像达到最清晰为止。现代显微镜一般在低倍物镜下调好焦点后，可直接转换高倍物镜。注意在高倍物镜下，视野内的字母能看到多大部分？与低倍物镜所见比较一下。

　　使用高倍物镜时，一定先从低倍物镜开始（如上步骤）。准备详细观察的标本部分，要移到视野正中央。在高倍物镜下调焦点只能用细调焦器，不能用粗调焦器。光阑要开大。

　　由低倍物镜转高倍物镜需多练习几次，要初步掌握使用方法。

　　观察粉蝶鳞片：用毛笔在粉蝶的翅上刷几下，在载玻片中央涂一涂，即有一些粉状物附于载玻片上，此即鳞片。于其上加一滴50％酒精。用镊子另取一干净盖玻片，先使盖玻片一边接触酒精，再轻轻放下，勿使盖玻片与载玻片间留有气泡，或使酒精逸出过多（这是临时装片的作法）。做好装片后在低倍物镜下观察，再转高倍物镜观察。粉蝶鳞片是什么形状？

　　观察完毕后，必须先把接物镜头转开，然后取出玻片标本。每次实验完毕后，都要把高、低倍接物镜转向前方，不可使接物镜正对着聚光器，然后放回镜箱（或镜柜）内。

　　要注意经常保持显微镜的清洁。如金属部分有灰尘时，一定要用清洁的软布擦干净。如镜头有灰尘时，必须用特备的擦镜纸轻轻地擦去。切勿用手或其他布、纸等擦拭，以免损坏透镜。

　　（三）标准实验室显微镜：图1-1所示为一种装配较完全的标准实验室显微镜（standardlaboratory microscope）剖面结构图。可按该显微镜的图注及其结构说明认识显微镜各部分结构，并想想各组成结构的功能。

　　标准实验室显微镜的结构（结合图1－1）说明：

　　光源（light source，L）：可以为一低电压的灯泡或为一较复杂的光源。

　　光源聚光器（lamp condenser，LC）：它将光源的像投射到孔径光阑的平面。

　　场光阑（field diaphragm，FD）：光阑的大小可调节，光阑限制光线照射到物体的面积。

　　镜台下聚光器（substage condenser，SC）：它将场光阑成像于物体平面。通常聚光器由两个调中心螺旋（centering screws，CS）调中心，由聚光器旋钮（condenser knob，K）通过齿轨上下移动调节焦点。

　　聚光器前透镜（front lens of the condenser，FL）：为邻近物体的透镜，用透镜旋钮（lensknob，LK）能将FL移出光路。在聚光器上可附有滤光器支架（filter carriers，FC）。

　　镜台下光阑（或孔径光阑，substage diaphragm or aperture diaphragm，AD）形成镜台下聚光器的入射光瞳（entrance pupil），并限制其数值孔径。用光阑杆（diaphragm lever，DL）调节该光阑的大小。缩小光阑可增加景深（depth of field），减小球面像差（sphericalaberration），并产生干涉条纹（interference fringes）增加反差，降低最后像的细节的可见度。

　　油浸聚光器（oil immersion condenser）：其上有OIL或OEL字样，它比干聚光器有较高的数值孔径。用时在前透镜和物体之间需加一层具一定折射率的油。

　　镜台（stage，ST）：转动镜台驱动器（stage drives，SD）旋钮可使镜台在X—Y方向移动。

　　粗、细调焦器（coarse and fine focusing knobs，FK）：大部分现代显微镜由粗、细调焦器提高和降低整个镜台—镜台下聚光器。在较老的显微镜，由粗、细调焦器调节镜筒使其提高与降低。

　　接物镜（objective lenses，OL）（或称物镜）：它们投射物体放大的像到位于目镜中的中间像平面（intermediate image plane）。3个或更多的物镜可装在一个能旋转的转换器上。物镜不同程度地校正了透镜的像差。消色差（achromats）是校正两种颜色，通常是蓝和红。复消色差（apochromats）是完全校正3种色（蓝、绿、红）。Plano物镜和相似标志的透镜是校正视场的曲率（curvature）失真。这些特别适用于照相。在接物镜镜筒上常见有PL25／0.50字样。“PL”表明这种透镜是特别校正的，产生平场（flat field）。这样高度校正的物镜必须与标示的补偿目镜合用，才能获得完全校正的效果。“25”表示中间像的放大，“0.50”表示数值孔径（numerical aperture，NA）。干透镜的 NA小于1（在g干透镜和标本之间有空气分开）。在油浸透镜能达到1.4。油浸透镜（oil immersion lenses）或称油物镜，在其镜筒上有OIL或OEL字样，其NA值可达1.4。使用时，在前透镜和标本之间必须加一层具一定折射率的液体油。否则，就干扰其校正并减低其NA。浸油与组织学制片所用的盖片有相似的折射率。光线经物体通过相近折射率的介质到达物镜。用油物镜时，盖玻片与前透镜之间的工作距离最短。如果盖片太厚则不能调焦点，现代高级物镜装有弹簧，物镜与盖片接触可不致损坏。

　　接目镜（ocular或eyepiece，O）或称目镜：它的作用是作为一个由物镜所产生的中间像的放大器。前透镜是主要的放大部件。向场透镜（field lens）能使更多的光线进入目镜。光阑位于前透镜的焦平面，是物镜形成中间像的位置。出射光瞳或目点 （exit pupil or eye point）是离开目镜的光锥最窄的部分。正确的位置，观察者的瞳孔与目点重合一致。高目点（high-eye point）目镜，戴眼镜者可直接进行观察。在高度校正的显微镜，目镜必须与特定的物镜配合使用以达到所要求的校正效果。

　　标准实验室显微镜的使用方法：作为一般观察与上述的使用方法基本相同。在条件较好的实验室，学生可根据上述的（二）显微镜使用方法，结合标准实验室显微镜的结构说明，自己操作使用。如果需要观察细胞组织的某些微细结构，可使用油物镜进一步放大观察。

　　油物镜的使用：首先在高倍于物镜（40×）下调准焦点，将要观察的标本某部分移至视野的正中心。然后，转动旋转器移开物镜，在盖片上视野中央的位置加一滴镜头油（具一定折射率的），再将油物镜移至该处，使前透镜与油滴接触。开大光阑，即可看到物像，上下稍动细调焦器则可看到清晰的物像。用后，将油物镜移至旁边，将最低倍物镜移至玻片标本上方，不宜将高倍物镜（40×）放在此处，以免玷污透镜。然后，用擦镜头纸沾镜头清洗液轻轻擦拭透镜。不宜用二甲苯或相似溶剂擦拭，以免损坏透镜中的胶合剂。

　　五、示范

　　显微镜有许多类型和型号，各有其不同的用途。根据实验室的条件，可示范或演示几种常用的新型显微镜。如果条件不够，可参看图1－2。

　　（一）实体显微镜或称立体显微镜（stereo microscope）：这种显微镜因可观察不透明物体表面的立体结构而得名。它具有多种形式的外加光源照明器，也有镜体内同轴垂直照明，使光线落射到所观察的物体上。还有兼具透射光照明器、荧光照明器和许多其他照明系统，扩大了使用范围。对可变焦距立体显微镜（zoom stero microscope）（Olympus生产的齐焦透镜，parfocal lenses）装在转换器上的两物镜使能快速连续地进行观察。一般放大倍数较低。新型的实体显微镜在向高分辨、高放大倍数发展。如SZX12镜总放大范围为2．1～675×（图1-2A）。

　　（二）暗视野显微镜（darkfield microscope）：其外形结构与普通显微镜一致。最主要的不同点是聚光器。由光源来的光线经过聚光器使光束经过物体落在物镜前透镜的外边。因此视野是黑暗的，通过物体本身的光反射和折射的光进入物镜形成亮的像，即标本在暗的背景上呈现出发亮的图像。这种显微镜适于观察具较大反射率、不同折射率或较透明的细胞组织切片或装片标本。

　　（三）相差显微镜（phase contrast microscope）：这种显微镜有具环形光阑（ring shaped“annular”diaphragm）的相差聚光器（phasecontrastcondenser）、相差物镜（phasecontrast图1—2几种新型的显微镜照片（自Olympus公司）objective，在镜筒上有“Ph”字）和相板（phase plate）。它主要是利用折射率的差异（如存在于相物体的）以形成亮／暗反差。光线经过具环形光阑的相差聚光器、物体、相差物镜，将光束分为两部分，一部分是物体结构的折射光，另一部分不受物体影响的光，经过相板二者干涉，形成干涉图像，由于两束光的相移位接近λ／2（半波长），可见反差分明的图像。适于观察较透明的或染色反差小的细胞组织切片或装片。

　　（四）荧光显微镜（fluorescence microscope）（图1－2B）：荧光来自于特定波长光辐射作用所激发的较高能级的电子跃迁而放出的一些具特定能量的光子（photon）（波长比激发光长）。例如，广泛应用的荧光染料其最大的激发光为490nm，而其发射光最大约为530nm。少数物质如叶绿素具固有的荧光（初级荧光），大部分生物材料需用荧光染料染色后，才显示出荧光，此为次级荧光。现代的显微镜使用入射光型（incident light mode），物镜用作为照明和物体观察。入射光型对激发作用和收集发射光是最有效的。荧光显微镜能鉴定极少量的荧光物质，通过选择滤光器能高度特异地鉴定一定的荧光染料。大量的组织化学、免疫细胞化学方法用荧光染料选择物质特异性染色，具有很高的敏感性和特殊性。

　　（五）倒置显微镜（inverted microscope）：与标准实验室显微镜表面上似无相似性，但实际，其组成部件和功能是一致的。只是聚光器倒过来在镜台之上，物镜在镜台之下（图1-2C）。工作距离较大，适于观察研究组织培养的细胞。

　　（六）研究用大型的显微镜，也有不同类型和型号，其中万能显微镜除具普通显微镜的功能外，还具有相差、暗视野、荧光、偏振光等显微镜的附件及功能（图1—2D）。

　　（七）有条件的实验室，可参观电子显微镜（electron microscope，EM），包括扫描电镜（scanning electron microscope，SEM）和透射电镜（transmission electron microscope，TEM）。

　　六、