显微镜

显微镜是用来观察、记录和研究经过制片技术处理后被检物体细微结构的最主要的光学精密仪器。它广泛地应用于各学科领域中，对微观世界的探索及理论的研究起着极其重要的作用。最常用的是普通光学显微镜，此外还有多种专用于不同显微术的显微镜，它们是利用不同的光学原理在显微镜基本设计的基础上发展而来的，如暗视野、荧光、相差显微镜等。

一、普通光学显微镜（optical microscope）

1. 显微镜术语　普通光学显微镜的基本工作原理是利用物镜和目镜的多组凸透镜将物像逐级放大并反射到视网膜上的过程。而显微镜的性能和质量的高低可通过分辨率、数值孔径、总放大倍率等指标来反映。

（1）分辨率：衡量光学系统分辨相隔微小距离的两个点能力的指标，即“能够分辨两点之间最小距离的能力”，称之为光学系统的分辨率。一个光学系统它所能分辨的两点之间的距离愈小，分辨率也就越高。

（2）数值孔径：数值孔径（N.A.）是决定物镜和聚光镜性能的一个重要参数。用下式表示：

这里n是在物镜、透镜和聚光镜与标本之间的一种介质（空气、浸油等）的折射率，而α则是孔径角的一半。数值孔径越大，图像就越明亮，分辨率越高。

（3）总放大倍率：显微镜的总放大倍率=单个物镜的放大倍率×目镜的放大倍率。

（4）光学筒长：是指从观察筒下端的结像透镜到插入目镜处的镜筒顶端的长度。

（5）工作距离：指当一个标本图像被清晰聚焦时，从物镜的前端到盖玻片的上表面的距离。通常，物镜的放大倍率越高，其工作距离便越短。

（6）物方视场：是指标本在显微镜下实际能被观察到圆形区域的直径（mm）。

（7）景深：指在对标本某一断面聚焦的状态下，该面前后同时能被看清的景物范围（深度）。物镜的N.A.值（数值孔径）越大，景深越浅。

2. 显微镜组成及各部分名称，见图8-17。

图8-17

3. 显微镜的使用

（1）把显微镜放在座前桌面上稍偏左的位置，镜座应距桌沿 6～7 cm左右。

（2）接通电源，打开光源开关，转动物镜转换器，使低倍镜头正对载物台上的通光孔，把孔径光阑调至最大，调节光强到合适大小，使光线通过聚光器入射到镜筒内，这时视野内呈明亮的状态。

（3）放置样品于载物台上，使样品中要被观察的部分位于通光孔的正中央，然后用标本夹夹好。用10×物镜聚焦，先转动粗调节旋钮，使载物台上升，物镜逐渐接近样品。然后注视目镜内（要养成睁开双眼用显微镜进行观察的习惯，以便在观察的同时能绘图），并转动细调节旋钮，使载物台慢慢下降，不久即可看到玻片中材料的放大物像。

（4）调节双目镜筒的光瞳距离，内退或外拉有刻度的滑板，使两眼都能看到样品，并使左右两个视场像合二为一。

（5）屈光度的调节：调节屈光度是为了适应观察者的视力。最简单的方法是先调节右侧目镜，同时用微调使标本聚焦，右眼看到清晰的图像。然后再用左眼观察，不动粗细调节旋钮，只转动左侧目镜的调节环，直至获得最清晰的图像。

（6）如果在视野内看到的物像不符合实验要求，可慢慢调节载物台移动手柄。调节时应注意玻片移动的方向与视野中看到的物像移动的方向正好相反。如果物像不甚清晰，可以调节微动调焦手轮，直至物像清晰为止。

（7）如果进一步使用高倍物镜观察，先把物像中需要放大观察的部分移至视野中央，再转换高倍物镜，这时物像不很清晰，可以转动微动调焦手轮进行调节。

（8）在转换高倍物镜并且看清物像之后，可以根据需要调节孔径光阑的大小或聚光器的高低，使光线符合要求（一般孔径光阑为视场光阑的60%~80%）。

（9）若要进一步放大物像，可用油镜。先将载物台缓缓落下，在要观察处滴1滴镜油，转换油镜，从侧面观察，谨慎旋转粗螺旋，使油镜头下降，浸入油滴中，注意勿用力下降过度，否则有压碎玻片和破坏油镜头的危险！然后用眼看目镜，轻轻转动粗螺旋，使油镜头慢慢上升，待看到模糊物像时，轻轻转动细螺旋，使像清晰。

（10）观察完毕，先将物镜镜头从通光孔处移开，然后将孔径光阑调至最大，再将载物台缓缓落下，镜油要用镜头纸擦净，并检查零件有无损伤，检查处理完毕后即可装箱。

4. 维护与保养

（1）透镜的清洁：①请勿用手或硬物接触光学镜片，若镜片表面不清洁，最好用柔软的刷子或纱布清除灰尘。可用擦镜纸或用脱脂棉，蘸少许酒精、乙醚混合液轻轻擦洗。②更多的较顽固的污迹如指纹、油脂等，可以用干净的软棉布、镜头纸或纱布蘸上无水乙醇轻轻擦去。③欲从油浸物镜上擦去浸油，应使用镜头纸、软棉布或纱布，蘸上少许酒精、乙醚混合液或二甲苯轻轻擦去。④不要用二甲苯清洗双目镜筒底部的入射透镜或目镜筒内的棱镜表面。⑤纯酒精和二甲苯均易燃烧，在将电源开关打开或关闭时特别要当心火灾的发生。

（2）油漆或塑料表面的清洁：①避免使用任何有机溶剂（如酒精、乙醚、稀释剂等）清洗仪器的油漆或塑料表面，建议使用硅布，更多的顽固污脏可以用软性清洗剂清洗之。②塑料表面只能用软布蘸上清水来清洁。

（3）显微镜存放：①当显微镜不用时，请用塑料罩盖好。安放在干燥、清洁、无震、无腐蚀性气体和阴凉通风的地方。②物镜和目镜应保存在干燥器一类的容器中，并放干燥剂。

（4）注意事项：①物镜在出厂时都经严格校正和检验，不得自行拆开。②为保持显微镜的性能，应进行定期检查。③粗动手轮松紧的调节，请一定使用调节手轮，切忌将两个粗动手轮向相反的方向同时旋转，以免造成损害。④仪器不用时，应切断电源，并用防尘罩罩好。

二、暗视野显微镜（ dark field microscope）

暗视野显微镜的分辨力比普通光学显微镜大。在检验中，主要用于未染色的螺旋体的形态和运动的观察；活体细菌虽可用于观察动力，但一般较少用。

（一）原理

与普通光学显微镜的区别在于两者的聚光器不同，暗视野显微镜装有一个中央为不透光的黑板遮盖的聚光器，光线不能直接射入镜筒，但可从四周边缘斜射到载玻片的标本上，尔后再经标本斜射而出。因光线是斜射的，不进入物镜，所以视野背景是黑暗的。由聚光器斜射到细菌等微粒上的光线，因光散射作用而发出亮光，反射到物镜内。这样在显微镜中可见到暗视野中明亮的物像。

（二）使用方法

1． 将显微镜上的明视野用普通聚光镜取下，将暗视野聚光镜调节到合适位置。

2． 在低倍镜下找聚光镜的光亮点或环状圈，并扭动暗视野聚光镜上附设的调节棒使亮点或环状圈移至视野的正中央。

3． 于聚光镜透镜面上滴加香柏油一滴，然后稍降下聚光镜，放置标本（载玻片厚度为 1mm ，盖玻片厚度为 0.17mm ）于载物台上，将聚光镜慢慢上移，使载玻片与聚光镜上的香柏油接触，先用高倍镜观察，后用油浸镜观察。用油浸镜观察时，在盖玻片上滴一滴香柏油，将物镜前透镜与标本上的香柏油接触。调焦，直至观察到清晰的标本像。

三、荧光显微镜 （fluorescence microscope）

荧光显微镜与普通光学显微镜基本相同，其主要区别在于光源和激发块。

1. 原理

（1）光源：荧光显微镜用高压汞灯作为光源（多用100w或200w）。此灯发出波长为300～700nm的光。

（2）激发块：选用适宜的激发块，选择所需要的激发光激发标本上的荧光素发光，最终使标本在暗的背景中呈现发出荧光的物体，易于观察。

 2. 使用方法

（1）打开灯源，超高压汞灯要等待3min后才能达到最大亮度。

（2）根据标本所标记的荧光素选择合适的激发块。

（3）用低倍镜观察待检标本，调节其亮区在视野中央，对焦后即可进行观察。根据需要转换所需倍数的物镜。用油浸镜时，必须使用无荧光镜油。

应当注意，在未装荧光遮光板时不要用眼观察，以免引起眼的损伤；标本不宜在镜下照射时间过长，否则会发生荧光淬灭而使亮度减弱；超高压汞灯一旦关闭至少等待30min后才能再次启动，以免损坏灯管。

四、相差显微镜 （phase-contrast microscope）

在检查不染色标本时，细菌的折光性与周围环境的折光性相近，用普通显微镜不易看清；用暗视野显微镜也只能看到发光的菌体外形，看不清内部结构。相差显微镜能弥补其不足，可使细胞结构与背底呈现出明暗反差。适用于检查不染色的活细菌的形态与某些结构。

1. 原理　两个波长与振幅相等的光 s与 p， s波一直在空气中进行，而 p波在途中经过一块折光率与空气不同的介质。在未通过介质前两波以同位相前进。 p波经介质时，由于介质的折光率不同就超前或落后于s波，出现了相位差。两个位相不同的光相遇发生干涉，使光加强或减弱。相差显微镜就是根据光波穿过标本中密度不同的部位时，用一块相差板的光栅作用，改变直射光的相位和振幅，将光的相位差转换成光的强度差，使细胞中的某些结构表现出明暗不同的对比。

2. 使用方法

（1）先将相差聚光镜装好，调节合适的亮度，标本置于载物台上。

（2）若用低倍物镜观察，则将低倍相差物镜转入光路，再转动聚光镜转盘，选择对应的相差环。取下目镜，换上聚焦望远镜，并调节焦距，至能同时看清接物镜中的暗圈（即相膜）和聚光镜上的亮圈。调节聚光镜两侧的对中旋钮，使暗、亮两圈相重叠。取下聚焦望远镜，换上目镜即可观察。

（3）若用高倍镜或油浸镜，须仿上述方法重新予以校正。

 

  思 考 题

 

1． 根据实验要求如何选择显微镜？

2． 如何正确使用普通光学显微镜？

 

                                           （黄小军、刘利兵）