单细胞多组学联合怎么做，GUT 教你设计方案策略

胰腺癌，公认的最致命的恶性肿瘤之一，其 5 年生存率仅为 9%，是名副其实的「癌王」。而现阶段针对它的治疗手段---免疫检查点抑制剂和化学抗原体细胞受体，疗效甚微。且肿瘤内部微环境中存在的中性粒细胞（TANs）浸润也被认为是影响肿瘤的最不利的预后因素之一。科学家通过查阅大量文献得出针对先天免疫系统的治疗干预可能为目前 PDAC 免疫疗法的替代方案。因此摆在科学家面前的最大问题就是如何让中性粒细胞（TANs）成功被「策反」，协助免疫系统击败肿瘤的侵染呢？

1.文章介绍

论著题目：Single-cell RNA-seq analysis reveals BHLHE40-driven pro-tumour neutrophils with hyperactivated glycolysis in pancreatic tumour microenvironment

发表期刊：GUT

影响因子：31.793（2022 年最新数据）

2.实验基础信息

样本信息：

5 名 PDAC 患者的外周血和 PDAC 组织、2 名健康人（HC）的外周血、2 名胰腺炎患者（CP）外周血样本，分离血液 CD66b+ 中性粒细胞（PMN）和胰腺癌组织 CD45+ 免疫细胞

单细胞捕获平台：BD Rhapsody^TM

单细胞实验分组：

HC-PMN（健康组）×2；CP-PMN（慢性胰腺炎组）×2；PDAC-PMN 细胞×5；PDAC免疫细胞×5

主要技术手段：

单细胞测序，空间转录组测序，转录组测序，蛋白组、代谢组质谱分析，免疫荧光，免疫组化，pcr（qpcr）分析

单细胞分析工具应用：

细胞聚类分析，subCluster 分析，差异基因表达分析，GO/Pathway 分析，拟时序分析，SCENIC 分析，cellphone 分析等。

3.研究成果解析

（1）中性粒细胞的异质性

基于前期队列研究发现，TANs 在 PDAC 中大量浸润，且与 PDAC 患者预后不良相关。利用单细胞测序，研究者共检测到 33891 个外周血中性粒细胞和 17932 个胰腺癌免疫细胞的转录组，进一步划分 8 种细胞类型，其中中性粒细胞存在两个细胞群体：Neutrophils1 存在于外周血样本，Neutrophils2 仅存在于肿瘤组织中。CellphoneDB 分析发现，相较于其他的免疫细胞，巨噬细胞与 TANs 间存在大量的配受体关系对，如 CCL13-CCR1,CCL3-CCR1 等，表明肿瘤微环境中两种细胞间的紧密相互作用，这也与免疫荧光染色中 TANs 和巨噬细胞间的物理距离接近的结果相互印证。

（2） TANs 异质性分析

为了进一步研究中性粒细胞的异质性，烈冰为研究者提供了 subCluster 分析，对 PDAC 患者的中性粒细胞细分，获得了 6 个PMN亚群和6个TAN亚群，PMNs 表现出相似的表达特征，而 TANs 存在异质性：TAN-1 亚群高表达血管生成因子 VEGFA、促转移因子 PLAU、LGALS3 等，表现为促癌的特征；TAN-2 与炎症相关（表达 NLRP3、CD69 和 IL1RN 等基因）；TAN-3 的基因表达特征和 PMNs 类似且高表达与中性粒细胞跨内皮迁移相关的基因（VNN2 和 SELL），说明 TAN-3 可能是迁移到肿瘤微环境中的过渡态细胞；而 TAN-4 特征性地高表达干扰素刺激基因。

（3） TAN-1 与 PDAC 患者不良预后相关

鉴于 TAN-3 的过渡态特征，研究者应用 monocle2 算法进一步构建了中性粒细胞状态轨迹的伪时间图，以 PMN 为分化的起点，逐渐转化为 TAN-3 过渡态，随后经过TAN-0 和 TAN-4 的状态，最后达到终末分化状态 TAN-2 和 TAN-1。研究者找到了1757 个随拟时轴显著变化的基因并可归类为 3 种表达模式，其中第 3 组基因在肿瘤微环境晚期被激活，并在缺氧、糖酵解、内质网（ER）应激、IL-1 和TNF 信号通路等过程富集。进一步，研究者利用 ER 应激诱导剂（毒胡萝卜素 (THG)、促炎细胞因子IL-1β 和 TNFα 以及缺氧的方式，体外刺激了中性粒细胞样分化的 HL-60（dHL-60）细胞，发现内质网应激和缺氧是诱导中性粒细胞向 TAN-1 表型分化的关键因子。

此外，免疫荧光和免疫组化染色证实在 PDAC 微环境中存在上述 4 个亚群。有趣的是，VEGFA+ TANs（TAN-1）通常位于癌细胞附近，使其能够发挥促肿瘤功能，结合多个临床数据的进一步分析显示，VEGFA+ TANs 和 PDAC 患者的不良预后显著相关。

（4）糖酵解显著增强TAN-1的促肿瘤能力

考虑到代谢状态与免疫细胞的表型、功能息息相关，研究人员进一步分析中性粒细胞的代谢特征，并发现与其他中性粒细胞亚群相比，糖酵解和缺氧在 TAN-1 亚群中显著上调；流式细胞分选的 LGALS3+ TAN（TAN-1）细胞中，葡萄糖转运蛋白 GLUT1 和糖酵解酶 HK2、PFKFB3 和 LDHA 的表达上调。为了进一步探索 TANs 代谢特征的空间分布规律，结合空间转录组测序技术，研究者发现相比于间质区，肿瘤和癌旁区域的中性粒细胞糖酵解活性显著上调，此外转录组测序、蛋白组和代谢组的多重分析均证实了相较于外周血 PMN，TAN 中糖酵解途径的显著富集。

那么糖酵解途径和 TANs 的促肿瘤功能有什么关联呢？基于 LDHA 是糖酵解途径的关键酶，也是 TAN-1 的关键标志基因，团队通过体外实验分析了过表达 LDHA 的dHL-60 细胞的功能特征，结果显示过表达 LDHA 可使 dHL60 细胞促进肿瘤细胞生长、抑制 T 细胞免疫应答。

（5） BHLHE40 驱动中性粒细胞向促肿瘤表型发展

进一步，研究团队通过 SCENIC 软件分析驱动 TANs 异质性的上游转录因子，发现转录因子 BHLHE40 在 TAN-1 中显著表达，调控 VEGFA、LGALS3、LDHA 和 BHLHE40等基因，促进中性粒细胞在肿瘤微环境中向促肿瘤的 TAN-1 表型分化。BHLHE40 过表达和敲除后，受其调节的上述基因的表达量也呈现相应的上调或下调，说明 BHLHE40是中性粒细胞向 TAN-1 表型极化的关键调节因子，染色质免疫沉淀实验也证实了BHLHE40 对促肿瘤基因的直接转录调节作用。

此外，过表达 BHLHE40 的 dHL-60 细胞和 PDAC 癌细胞共培养后，癌细胞的增殖和迁移能力显著增强。免疫学实验显示，BHLHE40 过表达抑制了 CD8+ T 细胞产生促炎细胞因子及淋巴细胞的增殖能力， BHLHE40+ 中性粒细胞的高浸润也与 PDAC 不良预后相关，说明 BHLHE40 是驱动中性粒细胞向促肿瘤和免疫抑制亚型分化的关键调控因子。

Summary

总的来说，研究者利用单细胞测序、空间转录组测序、免疫荧光、免疫组化、代谢组、蛋白组、转录组分析等多种技术手段，揭示了胰腺导管腺癌中中性粒细胞的作用。鉴定出了一个中性粒细胞的促肿瘤亚群—TAN-1，揭示了 TAN 中高糖酵解活性与促肿瘤功能之间的关联，并证明了缺氧和 ER 应激诱导的 BHLHE40 激活可驱动TAN 促肿瘤表型。

文章图文来源：烈冰生物