小鼠精子冷冻方法的漫漫「取经路」

第一道困境 也是故事开始的地方

第一个关于精子冷冻保存的报告要追溯到 200 多年前，1776 年，意大利牧师和生理学家 Lazaro Spallanzani 偶然发现将人的精液埋藏于冰雪中，一段时间后通过适当方法复温，发现仍有部分精子存活。但是他的发现并没有引起人们的重视，直到 1886 年 Mouteyazza 发展了冻存精子的方法，人们才对精子的冻存有了初步的认识。由于当时条件有限，冷冻后人的精子再进行复苏并没有达到理想的效果，很难在实际中广泛应用。

1938-1942 年 Hoagland 和 Pricus 用快速冷冻法将人精液冻存于液态氮中（－196℃），复苏后得到 20%－40% 的存活率，是冷冻技术的突破性发展阶段。在没有冷冻保护剂的情况下，冷休克和冰晶的形成会导致细胞中细胞器的损坏，也可能会损伤精子细胞结构（DNA、顶体和质膜等），最终降低受精能力。另外渗透压的变化也会破坏脂质膜结构，导致水通道蛋白的张力发生变化和质膜离子泄露，并导致精子形态发生改变。但是精子在冷冻和复苏过程中会收到不可避免的损伤，这就需要寻找一种有效的物质用来保护精子，避免或减轻因冷冻对精子造成的的损伤。

1949 年 Polge 找到了一种物质具有非常好的防冻性能——甘油（glycerol）。这一发现也成为了精子冷冻发展的重要里程碑。随后 1951 年（牛）、1953 年（人）、1957 年（猪、马）、1967 年（绵羊）等相继报道了利用冻存的精子得到后代。

第二道困境 小鼠精子的特异性

正当越来越多的哺乳动物精子使用甘油作为冷冻保护剂来冷冻保存时，有一种哺乳动物的精子冷冻遇到了麻烦——小鼠。研究者们单独使用甘油来冷冻小鼠精子，发现复苏后精子的受精率基本为零，这使得小鼠精子冷冻技术陷入了困境。

为了探究小鼠精子和其他哺乳动物精子的区别，研究者们做了很多研究，目前发现主要区别有两个，首先小鼠作为啮齿类家族一员，其精子在形态上和大部分啮齿类动物精子一样——头部弯曲为镰刀状，膜脂质含量或组成有很大的差异，且在镰刀状头部又分布有顶体酶，在冷冻过程中，精子头部结构非常容易造成损伤。其次在小鼠精子中，细胞骨架将质膜锚定在细胞的内部结构上，在渗透压力下，细胞膜上会产生额外的应变，该变化也会严重影响小鼠精子的活力。

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1990 年，科学家们发表了非常重要的三篇文章，第一篇，Tada 分析了冷冻在不同浓度的甘油或 DMSO 和 / 或甘油和棉子糖组合中的 ICR 品系和 5 个近交小鼠品系的精子反应。单独使用甘油或 DMSO 并不能提供任何保护，但将 1.75％ 甘油和 18％ 棉子糖组合使用可获得最佳效果（受精率为 30%-60%，生崽率平均 19%）；第二篇 Yokoyama 比较了两种可渗透性化合物的防冻性能。结果显示，在融化后 10％ 的棉子糖和 5％ 的甘油的组合或 10％ 的棉子糖和 10％DMSO 的组合提供了最高的精子活力（两种受精率平均为 35%）；第三篇，Okuyama 将 3％ 脱脂牛奶和 18％ 棉子糖的非渗透性组合用作 CPA。冷冻类似于 Yokoyama 的冷冻，将装有样品的试管浸入-80ºC 的酒精浴中，然后再转移到液氮中，获得了较好的结果。脱脂奶粉含有高分子蛋白，主要提高溶液粘度，提高玻璃化转变温度，维持溶液 pH 等作用。但是文章发表后，其他实验室很难重复结果。

1991 年，Takeshima, Nakagata and Ogawa 用 3％ 脱脂奶和 18％ 棉子糖冷冻保护剂又发表了一篇题为「小鼠精子的低温保存」的论文，文章记录了冷冻的详细过程和许多细节。通过比较，作者确定了 18％ 棉子糖溶液是提供最佳精子存活率的浓度。

1992 年，Nakagata 及其同事发表了 3 篇关于用 3％ 脱脂奶和棉子糖作为冷冻保护剂冷冻保存小鼠精子的论文，当精子以快速冷冻时比慢速冷冻时获得更好的体外受精率，结果将受精率从 30％ 提高到 86％。

在随后很多年里，一直有人在不断如何冷冻来提高受精率，有很多都是与甘油相关的保护剂，但是受精率和生崽率都不如 Nakagata 的 3％ 脱脂奶和 18％ 棉子糖组合。

「知识延伸」

冷冻保护剂分为渗透性性和非渗透性两大类。渗透性保护剂包括甘油、二甲基亚砜（DMSO）、二甲基乙醛、丙二醇和乙二醇等，这些物质可穿过细胞质膜，替换精子细胞中的水，达到冷冻保护的作用。但很多研究表面，这类保护剂在较高的浓度下对细胞有毒害作用，通常浓度为 1M，渗透作用会对细胞和精子造成「渗透损伤」，也使精子的受精能力显著降低；但是非渗透性保护剂，例如棉子糖、蔗糖、白蛋白，聚乙二醇和聚乙烯吡咯酮等，这类保护剂不能穿过质膜，但是在精子细胞周围提供了高渗透压环境，在冷冻过程中也能提供很好的保护作用。

第三道困境 小鼠不同品系的特异性

虽然上述方法能够对小鼠精子进行冷冻，且大多品系受精率能达到 80%，但是该方法对近交系 C57BL/6J 却不友好，冷冻复苏后受精率仅为 10%，而许多转基因小鼠都是以 C57BL/6J 为背景的，这让许多以 C57BL/6J 为背景做转基因小鼠的人感到头疼。C57BL/6J 精子冷冻后容易在顶体区和尾部区造成了严重的损伤。为了避免这周损伤，科学家们开始寻找合适添加剂，如防冻剂，抗氧化剂，防冻蛋白，脂肪酸，动物血清，纳米颗粒等来减少冷冻带来的损伤。

直到 2008 年，来自 Jackson Laboratory 的 C.Ostermeier 等人对脱脂牛奶 / 棉子糖冷冻小鼠精子方法的修改，方法是在 CPA（3％脱脂奶和 18％棉子糖组合）中添加单硫代甘油（MTG），这种方法能让 C57BL/6J 品系受精率提高到 60%。近交系 B6 冷冻的方案得到了质的提升，也能满足冷冻需求。

2010 年，Takeo 和 Nakagata 又改良了冷冻方案，即在原来的组合基础上添加了 L-谷氨酰胺，L-谷氨酰胺是血浆和组织中含量最丰富的游离氨基酸，L-谷氨酰胺具有通过与氨基酸的带正电荷的胺基团和带负电荷的磷脂相互作用来保护脂质膜的潜力，改良后的方法能使得 C57BL/6J 受精率达到 80%；到目前为止，Nakagata 冷冻小鼠精子的方法已经被全世界认可。

当然，精子冷冻结果的好坏也受诸多因素影响，除了冷冻保护剂的种类，还与小鼠品系、周龄、活力状态、冷冻时的环境温度、技术操作等有着很大的关系。科学永无止境，我们都在追求完美的路上，不断创新、试验、调整，在这里也向科学研究者表示崇高的敬意，感谢他们的研究与分享，也期待有一天冷冻技术会有一种更加「范特西」的方法。

参考文献

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