Nat Methods：殷昊团队开发不依赖 DNA 供体高效靶向插入基因组的新方法：GRAND editing
丁香学术
大部分遗传疾病都存在基因缺失或者部分序列错误，靶向性基因插入是治疗疾病的最佳方案之一。如何高效定点插入大片段 DNA 序列也成为基因编辑领域的难点和热点。
利用 CRISPR 基因编辑技术进行靶向插入的经典方法主要是同源重组修复，这种方法通过提供一个外源 DNA 供体，利用细胞自身的同源重组修复机制实现外源 DNA 片段的插入1。由于同源重组修复过程主要发生在细胞有丝分裂的 S/G2 期，限制了在非分裂细胞中的应用。相较于同源重组介导的片段插入，利用非同源末端连接虽然可以在非分裂细胞中实现片段插入，但由于存在效率低、副产物比率高的问题，无法达到有效插入2,3。因此，寻找一个不依赖细胞周期、高效靶向插入 DNA 片段的工具有重要意义。
2022 年 2 月 28 号，武汉大学医学研究院、教育部免疫和代谢前沿科学中心殷昊课题组在 Nature Methods 上发表了题为 Efficient targeted insertion of large DNA fragments without DNA donors 的研究论文，在 Prime editing 基础上，开发了一个由全新机制所介导的高效靶向插入系统：GRAND editing。
Prime editing 是 2019 年 Broad 研究所 David. Liu 团队研发出的一种可以在人类细胞进行 12 种碱基间变换，以及小片段插入和删除的基因编辑工具 4。Prime editing 通过在 nCas9 (H840A) 基础上连接逆转录酶，在含有 RNA 模板的 pegRNA 引导下，可实现不依赖外源 DNA 供体的小片段靶向插入（图 1，左）。由于其最长插入片段仅为 44 bp，无法满足大片段 DNA 精准插入的需求。
基于 prime editing 不需要 DNA 供体的优势，研究者们利用一对特殊的 pegRNAs 实现 20~1000 bp 大小的 DNA 片段靶向插入，该系统又称为 GRAND Editing（genome editing by RTTs partially aligned to each other but nonhomologous to target sequences within duo pegRNA）（图 1，右）。利用 GRAND Editing 系统，研究者们在不同细胞系的多个基因组位点证明，当插入片段大小为 150 bp，精准插入效率可达约 60%，当片段为 250 bp 时，插入效率也高达约 30%，并且此方法所产生的副产物很低，并检测不到脱靶。值得指出的是，研究者们在非分裂细胞中证实 GRAND editing 可以不依赖于 DNA 供体进行长片段序列的精准插入。
研究者们巧妙地利用一对特殊设计的 pegRNAs 来实现目的片段的靶向插入。这两条 pegRNAs 的 3' 端携带的逆转录模板（reverse transcription template, RTTs）含有一段碱基互补配对区域，并且 2 个 RTT 均和基因组的靶向位点无任何同源序列。当 RT 酶通过 pegRNA 3' 末端的 PBS（primer binding site）起始逆转录过程，产生 2 条末端互补配对的单链 DNA。这两条单链 DNA 通过互补配对产生了一段稳定的双链 DNA 结构，这样的编辑链和原始的基因组链之间相互竞争中具备优势，从而实现了外源片段的高效插入。同时，因为 GRAND editing 中的 RTTs 不需要与基因组同源配对，可以在 Flap 长度相同的情况下插入更长的外源片段。
图1 PE3 和 GRAND Editing 靶向插入外源 DNA 片段的设计概览图
研究者们首先在 EGFP 位点上验证了 GRAND editing 插入 20 bp 到约 1000 bp DNA 片段的可行性。研究者们设计了靶向插入 bsd 基因和补全破损的 EGFP 基因的实验，证明了 GRAND editing 可插入功能性基因或基因片段。研究者们进一步利用 GRAND editing 系统在多个内源性位点上均实现了高效靶向插入基因组，并且编辑的副产物占比很低。在与 Prime editing 的高效版本 PE3 比较中，GRAND editing 对于长片段靶向插入能力远高于 PE3。研究者们在数种细胞系中的多个位点和非分裂细胞中均证实了 GRAND editing 精准插入长片段的能力。
在对机制的探索中，研究者们发现 GRAND editing 需要以下几点的组合：一对 pegRNAs；pegRNAs 的 RTTs 部分互补；pegRNAs 与靶向的基因组无互补序列；2 个 nicks 间的序列需要删除等。
遗传缺失和单核苷酸多态性 (SNPs) 占已知人类基因组致病变异的 80% 以上 5。每个遗传病的致病基因通常具有几十到几百个会造成病理表型的 SNPs。但是通常由于携带每种突变的患者人数非常有限，很难针对单个 SNP 开发基因编辑药物。从实际情况出发，靶向插入基因序列或替换含突变热点的外显子是更理想的治疗方案。本研究开发了一种高效靶向插入大片段的方法，为遗传病的基因治疗和分子生物学研究提供新工具。因其无需 DNA 供体，可以 RNA 形式进行体内递送，实现体内定点插入，有利于基因药物开发。
