Annexin V 荧光双染细胞凋亡检测试剂盒实验操作指南

Annexin V是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸PS有高度亲和力，可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合，将Annexin V标记上荧光染料利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。

由于凋亡晚期或坏死细胞膜完整性丧失，细胞核染色液可进入细胞内染色细胞核，搭配Annexin V使用可将处于不同凋亡时期的细胞区分开。

A．悬浮细胞：

1. 按照实验方案进行凋亡诱导，300 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS洗涤细胞一次，轻轻重悬浮细胞并计数。
2. 取1~5 × 10⁵重悬的细胞，300 g离心5 min，弃上清。加入500 μL稀释成1 ×的Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞。
3. 细胞悬液中加入5 μL的荧光素标记-Annexin V和5 μL的细胞核染色液。
4. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min。
5. 反应完成后立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1 h内完成检测。
6. 检测

1）流式细胞仪检测

处理好的样本在流式细胞仪上检测。

2）荧光显微镜分析

取一滴用荧光素-Annexin V/细胞核染色液双染的细胞悬液（4步骤处理过的细胞悬液）于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。

B．贴壁细胞

一、流式细胞仪检测

1. 按照实验方案进行凋亡诱导，将培养基吸出转移至干净离心管内（待用），用无钙、镁离子的PBS清洗培养瓶细胞一次。
2. 培养瓶中加入适量的胰酶消化细胞，室温孵育至轻轻吹打可使贴壁细胞脱落，吸除胰酶消化液，避免胰酶消化过度。

注意：对于贴壁细胞，胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，从而导致细胞坏死的假阳性；消化时间如果过长，同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-荧光素的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。同时，胰酶细胞消化液中应尽量不含EDTA，因为EDTA可能会影响Annexin V与磷脂酰丝氨酸的结合。

1. 加入步骤1中收集的细胞培养液，将细胞轻轻吹打下来，转移到离心管内，300 g离心5 min，弃上清，收集细胞，用PBS洗涤细胞一次，轻轻悬浮细胞并计数。

注意：加入细胞培养液非常重要，一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶（残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-荧光素，导致染色失败）。

1. 取1~5× 10⁵重悬的细胞，300 g离心5 min，弃上清。加入500 μL稀释成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液重悬细胞。
2. 5.细胞悬液中加入5 μL的荧光素标记Annexin V和5μL的细胞核染色液。
3. 轻柔涡旋混匀后，室温避光孵育15~20 min。
4. 反应完成后立即上机检测。如不能及时检测，请于冰上避光静置并于1 h内完成检测。
5. 流式细胞仪检测。

二、荧光显微镜原位检测

注：本方法优点是可以原位观察细胞凋亡，缺点是部分凋亡由于贴壁不牢而检测不到。

1. 如果条件可以，在诱导凋亡后，用多孔板离心机300 g离心5 min。
2. 吸除细胞培养液，用PBS洗涤两次（如果条件允许，在此前做步骤A）。
3. 离心后弃上清，加入500 μL稀释成1 × 的Annexin V Binding Buffer工作液。
4. 加入5 μL的荧光素标记-Annexin V和5μL的细胞核染色液。
5. 移液器轻轻混匀，室温避光孵育15~20 min。
6. Annexin V Binding Buffer工作液洗涤细胞一次
7. 荧光显微镜检测。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。（如果无法观察，可以在孔板下铺上玻片使细胞贴附，最后取出用Annexin V Binding Buffer浸润观察。）
8. 反应完成后应立即观察，取出贴附细胞玻片时，避免细胞干片。