Caspase活性检测系列（分光光度法）检测原理及操作指南

一、检测原理

Caspase (Cysteine-requiring Aspartate Protease)是在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；在细胞发生凋亡阶段，Caspase被激活，活化的Caspase可裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

Caspase分光光度法检测试剂盒的原理是将Caspase序列特异性的多肽偶联至黄色发光基团pNA (p-nitroaniline)。当该底物被活化的Caspase剪切后，黄色发光基团pNA游离出来，可通过酶标仪或分光光度计（λ=405nm 或400nm）测定其吸光值，通过测定吸光度来检测Caspase的活性。

二、自备试剂

PBS、蛋白定量试剂盒(Bradford法,选用)

三、实验操作指南

1．准备工作：

A、 裂解液溶解后混匀，冰浴备用。

B、 裂解液工作液制备：每50 μL裂解液中加入0.5 μL DTT，冰浴备用。

2．样本处理：

A、悬浮细胞

1） 诱导完成后的细胞，2000 rpm离心5 min，弃上清，收集细胞，PBS轻轻重悬细胞并计数。

2） 2000 rpm离心5 min，弃上清。按照每200万细胞加入50 μL裂解液的比例加入预冷的裂解液工作液，重悬细胞。冰浴裂解30 min，期间涡旋震荡3~4次，每次10 s。

B、贴壁细胞

1） 按常规方法用胰酶消化贴壁细胞，收集细胞后2000 rpm离心5 min，弃上清。PBS轻轻重悬细胞并计数。

2） 2000 rpm离心5 min，弃上清。按照每200万细胞加入50 μL裂解液的比例加入预冷的裂解液工作液，重悬细胞。冰浴裂解30 min，期间涡旋震荡3~4次，每次10 s。

C、组织样本

1） 取50 mg组织置于培养皿中，手术剪剪碎，加入200 μL预冷的裂解液工作液，冰上用玻璃匀浆器匀浆 (组织量加倍时，加入的预冷裂解液也加倍)。

2） 将匀浆好的样本转移到1.5 mL的离心管中，冰浴放置5 min裂解。

3．12,000 rpm在4°C下离心10-15 min。

4．小心地吸取上清转移至新的EP管中，并置于冰上待用。

5．立即测定Caspase的酶活性或者-70°C保存样本，亦可取少量样本用Bradford法[E-BC-K168，详询当地经销商]测定蛋白浓度。

6．Caspase酶活性检测：

A、取Ac-特异性多肽-pNA和2 ×反应液，溶解后冰浴备用。

B、 2 ×反应液工作液制备：每50 μL 2 ×反应液加入0.5 μL DTT。

C、吸取45 μL含100-200 μg蛋白的细胞或者组织裂解上清，如体积不足45 μL则用裂解液工作液补足至45 μL（各组采用相同的蛋白含量和体系进行测定和比较）。

D、按照下表设置反应体系：

注意：

1） 在设置反应体系时先加入反应工作液，再加入待测样本后适当混匀，注意避免产生气泡。

2） 最后加入Ac-特异性多肽-pNA并混匀，注意避免气泡产生。

E、在加入Ac-特异性多肽-pNA混匀后，37℃孵育2~4 h。发现颜色变化较明显时即可测定OD405。如果颜色变化不明显可适当延长孵育时间，甚至可孵育过夜。

F、用酶标仪或分光光度计（100 μL比色皿）在λ=405 nm或400 nm测定样本吸光值。

G、通过计算OD_样本值/OD_阴性对照的倍数来确定凋亡诱导剂组Caspase 3的活化程度。

四、结果判断

Caspase的活性与AC-特异性多肽-pNA的分解量强弱成正比。

参考Chemicon公司的Caspase酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-peptide-pNA per hour at 37℃ under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底物饱和时，在37℃一个小时可以剪切1 nmol Ac特异性多肽-pNA产生1 nmol pNA的Caspase的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的Caspase。

说明：在本试剂盒的检测体系中，底物的起始浓度为0.2 mM，此时底物是饱和的，对于大部分样品而言，在37℃孵育4个小时以内底物都是饱和的；对于样品中Caspase酶活力特别高的情况，须用裂解液适当稀释样品后再进行测定。