DNA 甲基化检测与肿瘤的那些事儿

图 1 .北京市和海南省医保局发布新增医疗项目表（部分）

许多研究表明，肿瘤与一系列基因和表观遗传的异常改变有关。细胞生长和分裂过程中涉及到的关键通路发生了基因突变或表观遗传改变，就可能会诱导肿瘤的发生。在肿瘤细胞 DNA 中发生的分子变化如突变、易位和甲基化等，在循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）中也能反映出来。同时，DNA 甲基化与癌症中许多基因的表达沉默有关，在肿瘤基因组中发现了许多异常的甲基化改变。所以，分子诊断技术可根据表观遗传学原理，检测肿瘤抑制基因的甲基化程度来评价肿瘤发生的危险性。

循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），属于血液循环游离 DNA（cell-free DNA，cfDNA）的一种，作为近年来肿瘤领域检测的研究重点，在肿瘤无创前期早筛中具有重要应用价值。

图 2. ctDNA 的特征

循环游离 DNA（cfDNA）是血浆中来源于不同组织的核酸混合物，在健康人中其主要来源是造血系统。cfDNA 水平的升高与妊娠、组织损伤、炎症及肿瘤等有关。在癌症患者的血浆中，cfDNA的主要成分是肿瘤细胞释放的循环肿瘤 DNA（ctDNA）。ctDNA 反映了不同肿瘤部位转移的大小和活性的动态变化，其片段长度多小于 160 bp。ctDNA 在循环中的半衰期短，一般为 16 min~2.5 h，适用于肿瘤负荷的实时监测。我们通过对 ctDNA 序列分析可以监测肿瘤内的异质性和克隆进化，从而改善疾病控制和指导治疗决策。

DNA 甲基化是一种共价化学变化，在高等真核生物基因组仅发生在胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）中胞嘧啶的 C5 位，胞嘧啶结合一个甲基（CH₃）后形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。该反应由 DNA 甲基转移酶催化，CH₃ 基团来自s-腺苷甲硫氨酸。这些二核苷酸聚集成 CpG 岛（CCIs），50% 以上的基因启动子都含 CCIs，一般都集中在转录起始位点。甲基的存在导致了转录过程终止，从而使这些基因沉默。其机制主要与转录因子 CTCF（CCCTC binding factor）蛋白和甲基 CpG 结合蛋白（MBP）有关。CTCF 可以控制染色质三维结构的改变，促进或抑制不同位点的基因表达，但 CTCF 不能与甲基化CpG 结合，MBP 含有甲基化 CpGs 结合域，同时能与组蛋白去乙酰化酶（HDAC）结合，可重构染色质并抑制转录。

图 3. DNA 甲基化

从 DNA 甲基化层面看，肿瘤细胞与正常细胞的区别主要是全基因组范围低甲基化和特定序列 CpG 岛异常高甲基化。低甲基化主要发生在原癌基因启动子区域和非编码重复序列，这些序列的低甲基化会导致基因激活并破坏基因组稳定性，引起细胞异常增殖，最终诱发肿瘤。

在特定基因区域中，ctDNA 的异常甲基化具有较高的一致性，使得 DNA 甲基化检测在肿瘤诊断、监测、治疗效果和预后判断等方面比检测肿瘤特异突变更为广泛。所以，ctDNA 甲基化检测被认为是最有价值的癌症诊断和风险评估方法之一。

DNA 甲基化的临床应用领域包括非肿瘤与肿瘤疾病。非肿瘤甲基化检测主要用于炎症性疾病、代谢性疾病、感染性疾病、心血管疾病等。肿瘤甲基化检测主要用于肺癌、结肠癌、膀胱癌、乳腺癌等多种肿瘤的早期诊断和预后分析治疗等。

在癌症早期，DNA 序列已经出现了整体低甲基化的趋势和 CpG 岛局部高甲基化的改变。但由于肿瘤早期血浆中的 ctDNA水平很低，低甲基化检测在早期癌变中不敏感。不同类型癌症的高甲基化改变具有特异性，不同阶段癌症的血浆 ctDNA 水平也有差异，因此可以通过体液活检检测 ctDNA 的水平和甲基化特征来实现肿瘤的早期诊断以及分期。

相较于传统的肿瘤组织活检技术，ctDNA 液体活检具备更多优点，比如采样速度快，价格便宜，侵入性极小，同时能够追踪肿瘤的一系列发展变化。

异常的 DNA 甲基化可以提示肿瘤的侵袭性和手术切除后复发的风险。前面介绍到 ctDNA 的半衰期较短（约 16min ~ 2.5h），同时有研究显示，术后 ctDNA 在血液中的持久性与较差的预后相关。所以 ctDNA 的甲基化特征可以预测癌症患者的术后复发及死亡风险，有助于调整治疗方案，评估是否需要术后化疗以及确定化疗方案。

3.3治疗疗效的评估

体液活检采集 ctDNA 可多次重复取样，非常有利于在病程中评估治疗疗效、实时监测患者身体状况。与成像或传统的基于蛋白质的标记检测相比，ctDNA 的水平及其变化趋势可以提示患者对治疗药物的反应。体液活检还可用于监测接受靶向药物治疗的患者，提示复发风险和耐药性相关突变。

近年来涌现出很多 DNA 甲基化的检测技术，目前依据对目标 DNA 的预处理手段可将甲基化检测技术分为 3 类：

这种方法是利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区域不切割的特性，将 DNA 消化为不同大小的片段后再进行分析。常用的经典酶对是 Hpa II - Msp I（识别序列 CCGG ）。随后进行 Southern 或 PCR 扩增分离产物，以明确目标片段的甲基化状态。

图 4.甲基化敏感限制性内切酶（MSRE）法

3.4.2 基于亚硫酸盐修饰预处理的甲基化检测技术

这种方法是 DNA 经亚硫酸盐处理后，未甲基化的胞嘧啶（C）被转化成尿嘧啶（U），甲基化的胞嘧啶保持不变。处理后的 DNA 通过测序或使用特异性引物 PCR 得到非常准确的 DNA 序列甲基化位点信息。

图 5.基于亚硫酸盐修饰预处理的甲基化检测技术

3.4.3 基于亲和富集预处理的甲基化检测技术

基于亲和富集的 DNA 甲基化检测技术主要有甲基化 DNA 免疫沉淀技术（MeDIP）与甲基化 CpG 结合蛋白亲和捕获技术（MBDCap）：MeDIP 方法在将基因组 DNA 超声波打断并变性后，使用 5-甲基胞嘧啶特异性抗体富集甲基化片段，再分离纯化得到甲基化 DNA 片段，然后再用测序等方法分析；MBDCap 技术与 MeDIP 方法类似，利用甲基化 DNA 结合蛋白来对甲基化的 DNA 进行免疫沉淀，因为采用的富集蛋白不同，MeDIP 普遍富集 CpG 低密度的甲基化区域，而 MBDCap 则普遍富集 CpG 高密度的甲基化区域。

图 6.甲基化 DNA 免疫沉淀技术（MeDIP）

目前，基于 DNA 甲基化位点的检测产品陆续面世，给疾病诊断筛查带来福音。国内甲基化试剂盒转化商业产品集中在近几年，且获批的都为甲基化特异性 PCR 技术，主要原因还是该技术操作简便、特异性强、灵敏度高等特点。对于检测样本来说，目前相关的试剂盒检测样本类型多为 cfDNA ，特别是 ctDNA ，其检测方法具有早期、无创、快捷、灵敏度高等特点。

表 2. 国内NMPA获证情况

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文章图文来源：诺唯赞生物