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利用 MACSQuant Tyto 细胞分选实现帕金森病的首次人类 iPSC 衍生多巴胺能祖细胞临床移植试验

美天旎

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位于日本京都 CiRA (Center for iPS Cell Research and Application)的著名实验室,Jun Takahashi 教授团队正在使用 MACSQuant® Tyto® 细胞分选仪对 iPSC 衍生的多巴胺能祖细胞进行符合 GMP 的细胞分选,用于帕金森病细胞移植。

该团队目前的临床试验旨在利用 iPSC 衍生的多巴胺能神经元治疗帕金森病患者,该试验源自 2017 年 8 月发表在《自然》杂志上的灵长类动物模型研究。实际上,正是开创性工作的定义,人体试验在再生医学领域以及更远的领域受到了广泛关注,数十篇相关的新闻文章和报道,这在很大程度上要归功于诺贝尔奖得主 Shinya Yamanaka 的参与。

Dr. Daisuke Doi 作为 CiRA 助理教授并积极参与由 Jun Takahashi 教授领导的帕金森病临床试验项目。实验室开发一种基于 iPSC 衍生的多巴胺能祖细胞治疗帕金森病的新细胞疗法。在建立异基因 iPSC 细胞系(来自 HLA 纯合子供体)和神经诱导分化后,他们必须对 Corin 阳性神经祖细胞进行分选,以获得高纯度靶细胞群进一步培养并用于临床细胞移植。在临床前的工作中,他们使用传统的液滴式细胞分选仪对这些细胞进行分选。

Corin 阳性神经祖细胞分化为多巴胺能祖细胞,并最终移植到帕金森病患者体内。研究人员在细胞分选后获得了很好的纯度, 但低细胞存活率影响了后续细胞发展与功能。 此外,细胞分选过程需要大量的人力。Dr. Doi 说明 ”当使用传统的液滴式分选系统时,我们每 10 分钟手动更换一次分选瓶,且须不间断连续 16 小时;这对于一个有望成功的细胞治疗是不可行的。”因此,他们开始寻找其他细胞分选解决方案。

MACSQuant Tyto 细胞分选仪出现是完美的解决方案,因为具有基于微芯片的温和的细胞分选,封闭无菌分选环境, 使用符合GMP 级的耗材。 Dr. Doi 和他的同事们很惊讶地发现在MACSQuant Tyto 细胞分选后可获得更好的生存增长率细胞 虽然 在纯度和产量方面的分选性能与传统液滴式分选的细胞相似。然而通过观察神经球体大小和轴突延伸试验进一步强化 MACSQuant Tyto 细胞分选后细胞质量及其移植物的特性生存能力。且随着细胞存活率的提高,最终细胞终产品的总产量更高。 

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iPSC-derived neurons

在最初的临床试验中,Takahashi 教授的研究小组使用了一种传统的液滴式细胞分选系统来分离其细胞移植所需的 iPSC 来源的神经祖细胞。然而,细胞处理和分选性能仍有许多有待改进之处:低细胞产量和冗长操作时间对操作人员来说是一个巨大的负担,分选瓶需要每 10 分钟更换一次,且此过程需要连续操作 16 个小时。

在治疗第一个病人后,研究小组开始评估替代的临床流式细胞分选解决方案。

Takahashi 团队最终选择了 MACSQuant Tyto;因为它提供了其他任何选择都无法提供的优势:一个完全封闭的系统,利用阀门开合介导和无人值守的方式进行温和、无菌的细胞分选。该团队利用 MACSQuant Tyto 与传统的液滴式细胞分选机进行了头对头的比较,以验证这些说法。

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MACSQuant Tyto, 基于微芯片技术的细胞分选过程

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1. MQ Tyto 细胞分选可获得纯度超过 90%Corin 阳性多巴胺前体细胞 

(>90% purity of sorted Corin positive cells)

经由 MQ Tyto 一次分选或二次分选 Corin 阳性多巴胺前体细胞和传统液滴细胞分选仪比较,均能获得 90% 以上的细胞纯度与~50% 的细胞产率。

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2. 分选后的 Corin 阳性多巴胺前体细胞存活率高并具有增殖活力

(Post-sort survival and final yield increased by using MQ Tyto)

分选后的 Corin 阳性多巴胺前体细胞随后使之聚集形成球体(neurospheres) 以确保均匀分化,直到第 30 天,具有所需中脑表型的多巴胺能神经元被移植到 PD 患者的纹状体中。细胞存活率与细胞产量便以球体大小进行对比。经由 MQ Tyto 分选后所形成的 neurosphere 球体明显增大 1.3 倍,显示细胞存活率高并具有增殖活力

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3.MQ Tyto 分选后的 Corin 阳性多巴胺前体细胞在体外分化可促进神经突生长

(Increased neurite extension of MQ Tyto sorted cells indicated graft survival capacity and reinnervation)

MQ Tyto 分选后的 Corin 阳性多巴胺前体细胞在体外进一步分化成神经元,其神经纤维/神经突显著增长,由此用以检视移植后在人体内的移植细胞具有神经功能并延伸其神经突与宿主的脑细胞形成连接。

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4. MQ Tyto 大大减少操作时间

(Reduced operator time)

为获得 3x107 Corin 阳性多巴胺前体细胞, 相比以往传统液滴分选需不间断操作 16 小时,人员操 作MQ Tyto 仅需一小时。

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综上,利用 MQ Tyto 对干细胞分化的多巴胺前体细胞进行表面标记蛋白 Corin 分选,corin+ 纯度达 90%,细胞存活率高,且仍保有多巴胺神经分化功能。操作方便,且需人员操作的时间短。更重要的是,整个细胞分选过程是在一个密闭无菌的环境下完成;完全符合细胞移植临床试验的要求。

“使用 MACS GMP Tyto Cartrige 和 MACSQuant Tyto 细胞分选仪,我们能够将细胞生产时间缩短三分之一,并提高细胞产量。” MACSQuant Tyto 细胞分选仪及其符合 GMP 的耗材,包括便于监管机构批准临床试验的大量文件, Dr. Doi 和他的同事能够在较短的时间内产生更多的细胞终产品,允许细胞移植治疗可更快地在病人身上实现。

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