盘点 PCR 的七大应用领域

PCR 是众所周知的分子生物学技术之一。20 世纪 70 年代，研究人员首次报道了使用合成引物和 DNA 聚合酶从模板复制单链 DNA。然而直到 1983 年，Kary Mullis 才发明出用于扩增目标 DNA 的研究工具，就是我们今天所熟知的 PCR 方法。从此以后，PCR 成为分子生物学研究必不可少的一部分，被广泛应用于基础研究、疾病诊断、农业检测和法医调查等领域。

1.基因表达

通常可通过 PCR 来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出 RNA 并将mRNA逆转录成 cDNA。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定 mRNA 的初始水平。这一过程也被称为逆转录 PCR， RT-PCR （图 1）。

图 1. RT-PCR.RNA 被逆转录成 cDNA，随后通过 PCR 扩增 cDNA

终点 PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对 RNA 的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始 cDNA 进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点 PCR 得率可视化（图 2），然后对条带强度进行定量，并以管家基因为参照进行标准化，预估扩增靶点的相对表达水平[1,2]。如今，终点 PCR 已基本被实时 PCR 或 qPCR 取代了，因为它们可获得更可靠和更准确的基因表达定量结果。

图 2：起始 cDNA 连续稀释液的 PCR 得率，通过在琼脂糖凝胶上对 PCR 产物染色进行可视化观察。

2.基因分型

PCR 可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如，基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因分型[3]。引物对经设计位于目标区域侧翼，可根据是否存在扩增子及扩增子长度来检测遗传变异（图 3）。

图 3.PCR 用于转基因生物的等位基因分型。（A）可用针对目标区域的特异性PCR引物来检测基因位点是野生型序列（深灰色）还是转基因序列（黄色）。（B）如该凝胶照片所示，PCR 产物可用于确定基因型。在这些实验中，使用了野生型 (+/+)和转基因 (+/–和–/–) 小鼠的基因组 DNA。

但是如果为了检测特定核苷酸突变，则必须对扩增的序列进行进一步分析。例如， PCR 扩增子测序就是研究单核苷酸变异（SNVs）和单核苷酸多态性（SNP）的方法之一。强烈推荐使用高保真 DNA 聚合酶，以防止在 PCR 过程中引入多余的突变。

通过 PCR 进行基因分型也是对癌症和遗传病中的 突变进行遗传分析的一个基本方式。

3.分子克隆

PCR 被广泛应用于目标 DNA 片段的克隆，该技术被称为 PCR 克隆。在直接 PCR 克隆中，DNA（如，gDNA、cDNA、质粒 DNA）的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。

图 4.PCR 克隆：通过 PCR 制备的插入片段被克隆到兼容载体中。（A） 直接 PCR 克隆技术包括 TA 和平端克隆。（B）间接 PCR 克隆，扩增子可在插入到兼容载体之前被修饰，如进行限制性酶切。

除了制备插入片段，PCR 也是一种在在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向。

4.突变

PCR 克隆的一大优点是能够通过克隆将所需突变引入目的基因中，以便进行突变研究。在定点突变中，经过设计的 PCR 引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。如图 5所示，引物定位到已克隆至质粒中的序列上。随后，含有引入突变的 PCR 产物通过自我连接，重新生成环状质粒，并用于转化感受态细胞。

图 5.PCR 用于定点突变。该方法使用非重叠引物（红色星号=突变核苷酸，灰色线条 = 删除的序列，蓝色线条 = 插入的序列）。也可考虑使用其他引物设计，如具有 5′ 重叠序列的引物[4-6]。

图 6.使用含突变序列和同源末端序列的 PCR 引物进行的定点突变。该图所示方法阐述了 Invitrogen™ GeneArt™ 定点突变试剂盒的机制，其中，方块代表重组和突变位点。

5.甲基化

PCR 可用于研究位点特异性甲基化。在 甲基化特异性 PCR（MSP）方法中，设计了两个引物对，以区分目标位点的甲基化状态[7,8]。

首先使用重亚硫酸盐处理 DNA 样品，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶（m5C） 。为了检测甲基化位点，一对引物经设计带有鸟嘌呤（G），可与目标序列中的 m5C 配对；为了检测未甲基化位点，另一对引物带有腺嘌呤（A），可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对（随后，与后续 PCR 循环中的胸腺嘧啶（T）配对）。通过引物配对得到的阳性 PCR 扩增结果可用于确定位点的甲基化状态（图 7）。

图 7.甲基化特异性 PCR 第一步，使用重亚硫酸盐处理 DNA 样品，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。设计两个引物对（甲基化和未甲基化），从而根据重亚硫酸盐处理 DNA 的扩增结果来区分目标位点的甲基化状态[7,8]。

甲基化研究中所使用的 DNA 聚合酶除了能够扩增富含AT的序列，还必须能够读取识别重亚硫酸盐处理后 DNA 中的 U 残基。而高保真 DNA 聚合酶含有来自于古细菌起源的尿嘧啶结合域，所以不适用于 MSP（除非经过特殊修饰）。

实时 PCR 可代替终点 PCR，为 MSP 提供更准确的甲基化定量分析。利用实时 PCR，对 PCR 扩增子的熔解曲线分析是检测目标位点甲基化状态的一种替代性 PCR 方法。

6.测序

PCR 是为测序富集模板 DNA 的一种相对简单的方法。为保证 DNA 序列准确性，强烈建议使用高保真 PCR 来制备测序模板。

在 Sanger 测序中，PCR 扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点（如 M13 或 T7“通用引物”结合位点）对 PCR 引物的 5′末端进行标记，以简化测序工作流程（图 8）。

图 8.用于 Sanger 测序的 PCR 扩增子制备。使用常用测序引物位点标记 PCR 引物，以简化实验流程。

二代测序 （NGS）中，PCR 被广泛用于构建 DNA 测序文库。在 NGS 文库制备中，DNA 样品通过 PCR 反应富集（在起始量有限的情况下）并使用 adaptor（以及用于多重检测的index）标记（图 9）。除了具有高保真度，DNA 聚合酶还应具有最小的扩增偏好性，从而使测序文库具有高覆盖度。

图 9.使用 PCR 为新一代测序制备 DNA 样品。

7.医学、法医学和应用科学

PCR 技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的临床诊断、法医学调查和农业生物技术研究。这些应用要求可靠的性能、卓越的灵敏度和严格的标准。因此，所使用的 PCR 仪和 PCR 试剂必须符合这些要求和目的。

分子诊断应用包括基因检测、致癌突变检测以及感染性疾病检测。在法医学中，利用 PCR 进行人类身份鉴定是通过对独特的短串联重复序列（STR）进行扩增而区分个体的。在农业学中，PCR 在食物病原体检测、育种植物基因分型和 GMO 测试中具有重要作用。

参考文献：

1.Raeymaekers L (1999) General Principles of Quantitative PCR.In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols.Totowa, NJ: Humana Press. pp. 31–41.

2.Siebert PD (1999) Quantitative RT-PCR.In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols.Totowa, NJ: Humana Press. pp. 61-85.

3.Nobel Media AB (2014) The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information. nobelprize.org

4.Zheng L, Baumann U, Reymond JL (2004) An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.Nucleic Acids Res32(14):e115.

5.Liu H, Naismith JH (2008) An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.BMC Biotechnol8:91.

6.Xia Y, Chu W, Qi Q et al.(2015) New insights into the QuikChange™ process guide the use of Phusion DNA polymerase for site-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res43(2):e12.

7.Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996) Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc Natl Acad Sci U S A93(18):9821–9826.

8.Huang Z, Bassil CF, Murphy SK (2013) Methylation-specific PCR.Methods Mol Biol 1049:75–82.

文章来源：赛默飞世尔科技