PCR 新手指南——手把手教您如何正确选择合适的 PCR 酶

PCR 酶数量如此之多，选择正确的酶可能是一项挑战。用于扩增 DNA 的各种酶的保真性、扩增速度和特异性各不相同。以下三个问题可以帮助您解答选择 PCR 酶时需要重点关注的因素。

Q 1：您需要确保序列准确性吗？

有时您只需要检测 PCR 产物或估算其大小，例如在对小鼠进行基因分型或筛选重组克隆时。对于这种类型的常规 PCR 分析，您应该使用标准的热稳定 DNA 聚合酶（如 Taq DNA 聚合酶）来确认目的 DNA 存在与否。

但是，如果要执行克隆实验或下一代测序（NGS），那么准确性至关重要。为了确保准确进行 DNA 拷贝，请确保选择高保真 DNA 聚合酶。高保真 PCR 酶具有 3'-5’ 核酸外切酶校对活性。当结合错误匹配的碱基对时，DNA 聚合酶停顿，导致合成暂延。合成暂延 允许去除错误匹配的核苷酸并使用正确的核苷酸取代。

保持序列准确的 DNA 聚合酶的绝佳选择是 Invitrogen SuperFi 或 Thermo Scientific Phusion 高保真DNA聚合酶。这两种酶具有高保真度，准确度是 Taq DNA 聚合酶的 300 倍或 52 倍，并且具有很高的产率。

Q 2：您是否正在使用长链 DNA 模板，还是希望缩短循环时间？

当使用长链 DNA 模板时，您需要一种高效的 PCR 酶。在这种情况下，请选择具有高持续合成能力和高延伸率的聚合酶。合成能力代表在单个结合事件中 DNA 聚合酶可以结合的核苷酸数量。鉴于可处理核苷酸的数量，高合成能力的 DNA 聚合酶有助于长链模板的扩增。此外，高延伸率 DNA 聚合酶能够在更短的时间内扩增 DNA。具有高合成能力和延伸率的 PCR 酶可确保长链模板的有效 DNA 合成，并缩短循环时间。

Q 3：是否遇到了非特异性扩增的问题？

或许您在凝胶上看到了不应该出现的条带。这些额外的条带可能是非特异性扩增的一个例子（见图 1）。为了实现特定目标条带的高产率扩增，请选择热启动 DNA 聚合酶。只有当初始变性步骤达到 90°C 时，热启动 DNA 聚合酶才开始扩增。此功能有助于确保 PCR 反应不过早引发，得到不想要的非目标产物。此功能还有助于防止引物二聚体的形成，这在多重 PCR 和高通量 PCR 分析时特别有用。

用于高特异性和高通量应用的 DNA 聚合酶的推荐您选择 Invitrogen Platnium 热启动 DNA 聚合酶。

图 1.非特异性扩增（左图）与使用热启动 DNA 聚合酶进行的特异性扩增（右图）。

如何为您的 DNA 聚合酶选择正确的形式

还有更多需要考虑的因素。选择可以简化您工作流程的聚合酶形式。PCR 聚合酶形式的选择包括即用型预混液、用于直接凝胶上样的含染料缓冲液以及用于直接 PCR 分析的所有必要成分的完整试剂盒。

使用预混液，您只需添加模板和引物，然后，开始 PCR 实验。如果您想进一步减少操作步骤，使用含染料缓冲液的聚合酶允许 PCR 产物直接凝胶上样（注意：确保染料与下游应用兼容）。直接 PCR 试剂盒还可以帮助节省时间，使您跳过 DNA 纯化步骤，直接进行 DNA 扩增。尽管有这些选择，如果您想优化反应的特定组分，请使用单独的 DNA 聚合酶。

当您评估 PCR 实验所需的准确度、速度和特异性时，您就可以在品类繁多的 PCR 酶市场中可靠地选择适用于您分子生物学分析的适合 DNA 聚合酶。

文章来源：赛默飞世尔科技