临床实验研究

临床实验研究

胃粘膜检标本中弯曲菌样细菌的检出

　　1983年Wsrren和Marshall从慢性活动性胃炎患者胃粘膜上皮，发现有未经鉴定的螺状弯曲杆菌。此后经起了许多学者的研究。现在一般认为这是一群与胃部疾患、特别是浅表性胃炎和萎缩性胃炎有密切系的菌种，在许多生物学特性上与已认识的弯曲菌属很相似，但又有不同，故目前暂称之为弯曲菌样为细菌（Campylobacter－like organisms，简称CLOs）。我国慢性胃炎发病率很高，且认为可能与胃癌之发生有关。本文探讨了慢性胃炎胃粘膜活检中弯曲菌样细菌的检出方法，和在各种胃病中的检出情况。

　　1　材料及方法

　　1985年5～7月间，我们对98例有上消化道主诉的患者作内窥镜检查，分别作出内窥镜判断，并采取活检本作革兰染色镜检。其中大部分并作了细菌的分离培养。个别标本作了透射电镜的检查。内窥镜每作一次检查后，均用新洁尔灭消毒清洗。

　　1.1　光学显微镜检查

　　取胃粘膜上皮活检标本，在洁净玻上涂成约1.5cm×2.0cm的薄膜。自然干燥，加热固定，革兰染色后作油镜检查。

　　1.2　透射电子显微镜检查

　　新鲜活检标本在pH7.3的含2.0％戊二醛的二甲砷酸钠中固定2h。用二甲砷酸钠缓冲液洗2次，在1％四氧化锇中作后固定。然后包埋，超薄切片，在日立牌H－500电镜下观察。

　　1.3　分离培养

　　①Skirrow选择性培养基：以布氏琼脂作基础，补充10％羊血，并按下述浓度加入适量抗生素：万古毒素10mg/L，多粘菌素B2500IU/L，磺胺增效剂5mg/L。②接种和培养方法：取新鲜活检标本一块直接涂抹于上述选择性血琼脂一角，立即以接种环划线分离，并装入厌氧袋中（不用钯催化剂），封口后立即折断安瓿使枸橼酸与碳酸氢钠，硼氢酸钾产生化学反应，形成适量的CO₂ 与H₂ 。然后将盛有培养物的厌氧袋立即送至实验室。抵达实验室后即将培养物换入厌氧罐中，将厌氧罐用自制的厌氧培养抽气换气装置抽去90％大气，再充入80％N₂ 和10％CO₂ （大致相当于实际含O₂ 2.2％，N₂ 87.8％，CO₂ 10％），置37℃培养3d～4d进行观察。若细菌不纯，作再次分离传代。

　　1.4　鉴定试验

　　采用目前国内鉴定空肠弯曲菌的一组常规试验，包括菌落特征，细菌形态及染色性，动力，触酶及氧化酶试验，用三糖铁琼脂、醋酸铝滤纸条测葡萄糖分解及H2S的产生能力，1％甘氨酸、3.5％NaCl及0.04％TTC的耐受试验，42℃及室温生长试验，萘啶酸、红毒素、先锋毒素的药敏试验，马尿酸水解试验等。具体方法从略。

　　2　结果

　　2.1　CLOs的形态学

　　胃粘膜活检标本直拉涂片可见直径为0.3μm～0.5μmt和长达1.5μm～5.0μm的革兰染色阴性、弧形、“S”形、或微弯稍直的杆菌。大多大小均一，形态典型。绝大多数的形态与空肠弯曲菌相似，少数与胎儿弯曲菌胎儿亚种相似。在空腹采取的胃粘膜活检标中非常容易识别。在直接涂片中多数CLOs存在于粘液层中，常呈鱼贯状排列。有些菌株革兰染色下菌体周围有明显的空缺，似有荚膜样结构。细菌的数量多少相差非常悬殊。少至一张涂片上只能找到几个，多至无法计数。为了大致能反映出活检标本中菌量的差异，拟订了一个粗略的定量标准如下：①极少：整个涂片仔细寻找形态典型的CLOs在5个以下有（本组有11例）。②少许：整个涂片仔细寻找形态典型的CLOs在5～50个左右（本组有8例）。③＋：密集处一个视野中形态典型的CLOs不超过5个左右（本组有24例）。④++：密集处一个视野中形态典型的CLOs达50～500个左右（本组有16例）。⑤+++：密集处一个视野中形态典型的CLOs达50～500个左右（本组有8例）。⑥++++：密集处一个野中形态典型的CLOs＞500，到无法计数（本组有4例）。此外本组98例中仅见杂菌者23例，基本未找到细菌要结构者4例。

　　由上可见胃粘膜涂片中，71/98或72.2％可找到CLOs，1/4病例仅见杂菌，且大多数杂菌量很少，只少数能打“＋”以上。因杂菌多而CLOs难于识别者仅偶见。尽管在71例CLOs阳性标本中偶而亦可见杂菌，由于CLOs占绝大多数且与杂菌量有明显差别，所居部位亦不同，再加上CLOs在直接涂片中均有典型的态特征，因此藉直接涂片识别CLOs并不感到困难。在直接涂片中亦可偶见与革兰阴性球菌形态完全不同的圆球状体结构。经分离培养证实它是CLOs的一种形态变异，是否系CLOs的细胞壁缺陷型有待探讨。这种CLOs的形态变异具有大小不一、染色不匀、周界较模糊的特征，对有经验者识别并不困难。

　　在一例患者十二指肠球部溃疡和浅表性胃炎者，其胃窦部粘膜在透射电镜检查中，可见在紧贴胃粘膜上皮表面处密布着一层外壳滑的CLOs。似乎完全镶嵌在微绒毛的间隙里，而且排列仅有定向。CLOs几乎绝大多数呈纵断面，因此尚能见弯曲菌形态特征，而在同一病人另一张不同切面的照片中所见都是在粘膜上皮表面排列得整整齐齐的菌体的横断面。这种情况似乎与直接镜检中所见CLOs在粘液层中排列成钱贯状相呼应。而且突出的是，与粘膜上皮构成这种致密关系的菌体仅见一层；重叠二层；三层以上者几乎未见。另外尚可见有7个细菌侵入壁细胞的细胞内小管。Marshall等在电镜中发现CLOs具有4～5条带鞘的鞭毛，他认为这是与只有一条无鞘鞭毛的弯曲菌属细菌之间的重要区别，并由此认为CLOs可能属螺菌属，而不属弯曲菌属。我们在这一活检标本的一个切面中发现一条CLOs的一端有两条清晰的鞭毛另外一些CLOs的末端亦有2～4条鞭毛的断端。但是Kasper分离到的CLO菌株仅有一根鞭毛。

　　2.2　CLOs的培养及生化特性

　　我们对66份活检标本作了CLOs的分离培养。根据CLOs是一类革兰阳性在微需氧条件下37℃生长的弯曲菌样细菌，其生化特片至少有1～2项以上不同于先前已描述的变曲菌属细菌的特征标准，分离到27株可以定名属于CLOs的细菌。现将其主要特征描述如下：①菌落形态：CLOs在Skirrow培养基上培养48h出现针尖状透明无色菌落。72h后发展成灰白或灰色，隆起或扁平的菌落，直径＜1min，或稍大，在新鲜培养基上有时可见形成扩散生长的菌落，但多数是互相独立的，不如空肠弯曲菌那样易形成透明扩散型水滴样菌落。部分菌株的菌落有特殊的酸味。②形态和动力：CLOs在新鲜在培养物中，能见典型的弯曲菌样形态，但是与直接涂片镜检相比，则菌体稍长而弯曲度较不明是，染色亦有较淡的趋势，另外在48h以上的培养物中，及条件不适宜的情况下易变成圆球状结构，须与革兰阴性球菌区别。一般革兰阴性球菌有大小一致、染色较均匀及周界清晰的特点，而CLOs的圆球状变异则大小很不均一，染色很能不均匀，周界亦较模糊。CLOs在布氏肉汤中在暗视野显微镜下可见明显的动力。运动的形式可见螺旋状转动，亦可在原位呈现翻滚运动。③生化和耐受试验；目前对CLOs尚未形成成套的生化鉴定试验，我们利用对空肠弯曲菌鉴定常用的一些试验来测试了解其特性。与弯曲菌样细菌相仿，触酶绝大多数是阳性的。另外氧化酶多数阳性，少数阴性。它们普遍不利用糖，因此三糖铁琼脂是阴性的，且不变黑。但在醋酸银滤纸条上可见轻微的黑色，说明能产生微量的H₂ s。几乎绝大多数菌株对1％甘氨酸和0.04％TTC耐受，在3.5％NaCI中不生长。在温度耐受生长试验中少数菌株能在42℃生长，室温（约25℃～35℃）条件下发现少数菌株能够生长。马尿酸水解试验也是部分阴性，部分阳性。在药敏试验中绝大多数对红毒素敏感，对萘啶酸部分敏感，部分耐药。对先锋毒素亦有部分是敏感的，这与空肠弯曲菌明显不同。

表1　CLOs在各种胃病中检出情况

项　目	浅表性胃炎	浅表萎缩性胃炎	萎缩性胃炎	溃疡	胃癌	残胃炎	糜烂性胃炎	无异常	合计
总例数	47	21	14	3	5	3	4	1	98
CLO阳性数	34	16	9	2	3	3	4	0	71
百分率(％)	72.3	76.2	69.3	66.7	60	100	100	0	72.5

　　2.3　各类胃部疾患的CLOs检出率

　　可见浅表性胃炎，浅表一萎缩性胃炎，萎缩性胃炎的阳性检出率占总阳检出率的72.5％（表1）。

　　3　讨论

　　普遍认为，CLOs是一类与弯曲菌属不同的另一类微生物。因其生长与生化特性与弯曲菌属有许多不同，DNA的G＋C含量 与弯曲菌属亦有不同，而且它们之间不能进行杂交，甚至CLOs不同群之间亦不能进行杂交。故常规分离培养空肠弯曲菌的方法来分离培养用CLOs，不易取得成功。例如最初我们用Campy－BAP选择性培养基在42℃下分离培养未取得一例成功。这可能与这类细菌通常只能在37℃下生长而且不少株对先锋霉素Ⅰ敏感有关。另外由于这类细菌与弯曲菌属细菌在不能分解糖类和在许多试验中反应不活跃，又很相似；但在个别菌株的表现型上又各有差异，因之又很不相似。因此企图完全用传统的表现型的分解方法得出分群或分型的结论是很困难的。目前除最新报道的个别据认为有价值的试验（如硝酸盐还原反应，尿素酶试验等）外，主要靠DNA的G＋C含量，杂交试验，及菌体蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上的电泳谱来鉴别。

　　胃中酸度比较强，一般细菌难以生存，但CLOs例外，能在胃粘膜上定值。尽管它可能有碱性的粘液保护，但仍然可能具有一定程度的耐酸性。这可从中许多细菌侵犯壁细胞内的泌酸小管得到证明。另外电镜中显示粘膜上皮表面只有紧贴的单层CLOs，这可能意味着CLOs与胃粘膜有特殊的亲和性，有可能粘膜上皮表面有某种特殊的受体。

　　由于这类细菌的生长速度较常见的弯曲菌属细菌为慢，例如空肠弯曲菌在Campy－BAP培养基上42℃24～48h即可见明显菌落，这类细菌据报道一般需要培养2d～7d，大多在3d～4d形成明显菌落。我们在2d～4d内观察结果，这时胃粘膜上的杂菌尽管相对较少，但由于生长较快，在2d～4d观察结果时可能被杂菌掩盖了一部分。这类细菌对多种抗生素较敏感，若选用抑制性太强的培养基，则CLOs一起被抑制，若选用抑制性弱的培养基或不加抗生素，则杂菌生长太多难于分离。另外人类的弯曲菌属的菌株不是都能分离到的。这一点对CLOs来说亦是如此。