丙型肝炎病毒准种特性的研究进展
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丙型病毒性肝炎(丙肝)是一种广泛传播的疾病，是导致慢性病毒性肝炎、肝炎肝硬变、肝细胞癌(HCC)的主要病因之一，而这些病变形成与其病原丙型肝炎病毒（HCV)某些重要的生物学特性有关〔1〕。与其他RNA病毒类似，HCV基因组的易变异性可产生不同的型或亚型，而且在HCV感染者体内可同时存在具有多种序列组成不同但却有很高同源性(同源性≥95%)的HCV变异株病毒群体，即称为HCV准种(Quasispecies)，亦有相似株和类似株之称〔2,3〕。近年来研究表明，HCV准种株决定其某些重要的生物学特性，而且大部分学者己惯用“准种”来监测和量化HCV在患者体内的复制及变异。现就有关研究作一概述。
1 HCV准种株特性
1971年Eigen等〔4〕在描述地球早期生命演化时，启用了“准种株”这一概念。以后人们在分析噬菌体Qβ群中单个病毒克隆的RNA时发现“准种株”的确存在，并将其引入了病毒的研究，以求循一个新途径来解释和说明病毒的高度变异性问题〔5〕。HCV属于单股正连RNA病毒，其基因组包膜糖蛋白区E2/NS1基因组C端相对保守，N端含有两个高变区域(Hypervariable region，HVR)即HVR1(384～410/413 aa)和HVR2(474～480 aa)。研究发现HVR1含有病毒株特异的中和性抗原表位，它的变异与丙肝慢性化及防治失败密切相关〔6〕。HCV感染者体内可同时存在大量基因序列相关的HCV准种株群体，而且会随病情和/或病程不同而发生变化〔7，8〕。这种序列异质性变异株可发生在HCV基因组的各区段，包括5′-非编码区(5′-UTR)、核心区(C区)、包膜区（E区)及非结构蛋白区(NS区)等均有报道〔9-11〕。最近，Gerotto等〔12〕报道了HCV-NS5A干扰素敏感决定区(IFN Sensitivity-determing region，ISDR)准种特性，认为其会影响到HCV 1b型感染者对IFN治疗的应答。但有研究证实约20%序列变异发生在E2/NS1区，HCV准种株特性在HVR1表现较明显而更具有代表性〔11，13，14〕。
2 HCV准种株的量化
随着分子生物学技术的广泛应用，目前主要以准种HCV基因的复杂性(Complexity)或异质性(Heterogeneity)程度来对其进行量化，主要有以下几种方法:①直接测序法〔15〕。针对特定区段RNA序列进行体外逆转录扩增（RT-PCR)得到相应的cDNA，然后用PCR扩增产物直接测序或克隆后测序，根据异质性序列种类(diversity)来评价该区段准种株多寡。②单链构象多态性分析法(Single-strand conformation polymophism analysis,SSCP)〔l6，l7〕。此法是在完成靶DNA的PCR扩增之后进行单链DNA多态性分析的一种新方法，将单链扩增DNA(引物已用同位素或荧光标记)通过中性聚丙烯烯胺凝胶电泳(PAGE）和放射自显影，根据其 SSCP条带数目及位置不同则可分辨出序列单个碱基和构型改变，由此来判断体内准种株的复杂程度。③异源双链泳动分析法(Heteroduplex mobility assay,HMA/heteroduplex gel shift analysis，GSA),亦称异源双链示踪检测法（Heteroduplex tracking assay,HTA)〔10,18,19〕。此法早期主要用于艾滋病病毒异质性研究，主要原理是基于DNA分子的变性和复性过程。在DNA经过变性后复性时，如反应系统中存在两种或两种以上具有一定同源性的核酸分子链，不同来源的两链同源区可配对形成双链，此即异源双链;异源双链内由于存在碱基错配或不配区域，分子构象发生了改变，不同于同源双链，通过非变性的PAGE ，同源性越高，泳动就越快，反之则慢。比较而言，第一种方法结果直接而可靠，但较原始且费力费时，直接PCR产品克隆和序列分析往往不能代表HCV准种株的真实组成，虽容易鉴别出优势序列，但小的克隆很可能被忽略掉。PCR-SSCP法应用较广，但对低于5%的准种株病毒群体亦有可能检测不到，而且操作烦琐〔20〕。相比之下，HMA法操作相对简单省时，可用于基因亚型的测定。这些方法学上的差异在一定程度上可能决定了各学者在研究HCV准种特性时某些结论的不一致，所以寻求一种更准确、简便而重复性较好的方法是必需的。
3 HCV准种的优势株与劣势株
有研究认为〔21，22〕，对 HCV准种株群体变化可能有三种解释:①HCV变异是HCV感染人体后随时间变化而自发产生的;②病情严重时，HCV复制更加活跃，复制期间“易错配”(Error-prone)的RNA聚合酶导致了序列变异;③正性免疫选择压力(Positive immune selective pressure)作用所致病毒适应环境的结果。因此，在大量的准种株中，可能有一个或几个主序列，主序列代表特定环境下最适应的基因群。主序列与其他序列的关系也就构成了复杂的“优势株”与“劣势株”关系，而且很可能有序列优势株和功能优势株之别，它们与HCV感染后疾病的转归关系尚不清楚。Gretch等〔19〕采用HTA方法观察了5例HCV-1型感染患者肝移植前后血清中HCV HVR1准种及优势株(Major varants)的变化。发现3例移植后再发严重肝病的患者，其移植前存在的优势株在移植后即出现了明显的复制增殖并伴随病情从急性发展为慢性;相反，在2例移植后发展为无症状的感染者体内，虽然病毒滴度仍高，但移植正常肝后原来的优势序列很快消失，而在 30 d左右即出现了新的HVR1准种株，序列分析发现，新的病毒准种株实际上来源于移植前就存在的次要变异株（＜5%HVR克隆)。作者认为HCV感染患者血清中有一种或多种优势变异株存在，与同时存在的其它次要株之间关系复杂，它们在肝组织嗜性、致病能力、肝外复制及免疫压力选择作用方面可能均不一致，从而联系到不同的疾病过程。国内潘文胜等〔23〕对两例HCV持续感染患者5年的HVR基因变异研究发现:①HVR的变异具有高度复杂性，但不是杂乱无章，而是有规律地朝着一个方向发展，不管是感染早期的优势克隆或劣势克隆，随着病程发展，绝大多数均会消失，取而代之的是新的优势克隆;②HVR变异存在优势克隆劣转的现象，可能由于免疫系统首先攻击的主要对象是优势克隆，逃避免疫清除的劣势克隆可优势化，这也解释了按优势克隆合成的多肽没有完全保护性的现象。
4 HCV准种株的分布
有研究表明，HCV可在肝外组织复制，Sakamoto等〔24〕研究曾发现不同丙肝的临床病程中，患者肝组织及血浆中的HCV准种株并无明显差异。但目前大部分学者认为其分布是不一致的，这种分布差异性具体机理尚不清楚;不过，肝外组织或细胞检出HCV准种株均提示HCV感染，而不是简单的病毒吸附作用〔15，22〕。这种异质性序列分布差异在用HCV感染黑猩猩时亦有报道，且某些有特别优势包括能逃避宿主免疫和在某些组织内复制的HCV株可持续存在〔25〕。Fujii等〔26〕利用PCR-SSCP法，对11例慢性丙肝患者血清及外周血单个核细胞(PBMC)中的HVR1准种株进行了比较研究后，发现有4例(36%)血清及PBMC中的HVR1准种株序列变异是一致的，2例(18%)HVR1准种株群体和序列变异均不同，另5例(45%)既未出现准种株群体改变亦末现HVR1序列变异。提示HCV感染者血清及PBMC中有不同准种株存在，而血清中HVR1准种株明显多于PBMC可能因为暴露于宿主免疫的PBMC相对不如肝组织，从而产生免疫压力差异所致。Cabot等〔22〕收集了39例HCV1b型感染的不同病情的患者的肝组织，通过对其与血清中HCV E2-NS2段核苷酸和氨基酸复杂性比较，发现95%的患者相应的氨基酸序列是一致的;有26%的患者HCV准种复杂性血清中高于肝组织，28%的患者低于肝组织，41%的患者两者相同，同样认为可能与病毒在肝细胞内复制和血浆中循环的选择性压力不同有关。早些时候Maggi等〔27〕研究比较了10例丙肝患者肝组织、PBMC及血浆中HCV E2/NS1区准种株的分布情况，结果发现所有患者肝组织及PBMC中HCV准种株有明显不同。尽管在血浆中有肯定的HCV突变株存在，但存在于肝组织和/或PBMC中的突变株并未在相应的血浆中检测到;另外，亦末发现明显的特异性嗜组织株。而最近Laskus等〔9〕研究则认为各种组织和PBMC可选择性吸附E2区不同的病毒亚群，从而影响到准种分布。
综上所述，尽管HCV准种株现象己经得到肯定，但为了更好地掌握HCV在体内的变异情况，其量化方法应更进一步完善和标准化。由于它决定着HCV某些重要的生物学特性，有必要建立有效的细胞和动物 HCV感染模型，进一步明确优势株与劣势株之间关系及其分布差异的重要意义。我们相信，随着对HCV变异和准种株的深入研究，必然会给临床HCV感染的有效防治带来希望。
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