丁香实验_LOGO
登录
提问
我要登录
|免费注册
点赞
收藏
wx-share
分享

DNA电镜技术及其应用

互联网

3428
 
关键词: DNA 电镜技术 应用

  电子显微镜作为一种研究工具在核酸研究中已发挥很大作用并日益受到重视。1859年人们首先发现核酸为活体组织细胞核的主要组成成分,90年后又在电镜下观察到单个核酸分子,而Avery等于1944年发现核酸是遗传的分子基础后,更激起人们了解核酸物理结构的兴趣。1959年Aleinschmedt及Zahn建立了一种新的电镜技术,即细胞色素C展层技术(又称碱性蛋白 膜技术及Kleinschmice-Zahn技术),并成功地在电镜下观察到双链DNA (dsDNA )分子,开始了应用电子显微镜研究DNA 结构和功能的新时代[1]。以后经过方法学上的不断改进,又发展了许多新的技术,广泛应用于DNA 结构与功能以及蛋白 质-DNA 相互作用的研究。我们参阅了近三十多年的有关文献并结合本实验室从事核酸电镜技术研究的体会,就DNA 电镜的常用技术及其基本应用加以介绍。

  1 DNA 电镜样品制备方法

  1.1 细胞色素C展层技术(碱性蛋白 膜技术)[2,3] 溶液中的DNA 分子呈三维无规则超卷曲状态,电镜观察前必须将DNA 分子变为二维伸展状态非聚集分子。细胞色素C展层技术的原理就是将DNA 溶液与碱性蛋白 (细胞色素C)混合,带负电的DNA 分子非特异性吸附大量细胞色素C,而后者具有在水或低盐溶液表面变性形成单层膜的特性,这时缠绕其中的DNA 分子也随之展开呈二维伸展状态。将变性剂(如甲酰胺等)加入展开液中,可以防止单链DNA 分子内碱基非随机配对。细胞色素C展层技术不仅可以用于观察双链DNA 分子(dsDNA ),也可用于观察单链DNA 分子(ssDNA ),此时该方法也可称甲酰胺展层技术。展开液(上相液)中含0.1~0.5 μg/ml的DNA 分子,0.1~0.25 mg/ml的细胞色素C,40%~60%的甲酰胺,缓冲液的pH为8.5。展开液沿斜面流至下相液(蒸馏水或10%甲酰胺,10 mM TriundefinedHCL, 1mM EDTA pH8.5)上展开,尔后用覆有支持膜的铜网取样。单链DNA 分子用此法也能较好地展开,其直径稍细,形态较为曲折。下相液中甲酰胺浓度比上相液中低30%,缓冲液离子浓度为上相液中的10%。

  1.2 扩散方法[4] 扩散方法是碱性蛋白 膜技术的一种变化形式,其原理是碱性蛋白 在含DNA 的下相液表面形成单层蛋白 膜,DNA 分子通过扩散运动与蛋白 膜接触并吸附其上。该方法可以大大减缓展层过程中的剪切力,尤其适用于较长的DNA 分子。其制样过程为:配制混液,将20 ng/ml的DNA ,0.2M醋酸胺(pH6.0),加于小塑料平皿中;将一细针头蘸取细胞色素C粉末轻轻触及下相液表面,静置10~30 min,使DNA 扩散并吸附到蛋白 膜上,用铜网取样。对此方法进一步简化,建立了一步吸附法。配制DNA 及细胞色素C混合液,细胞色素C形成单层膜的同时,DNA 分子经过扩散与对流吸附其上,静置4~5 min,铜网取样。DNA 的吸附量与其浓度及大小有关,与(时间)3/2成正比。该方法的优点是所用DNA 量较少,另外在展开单链DNA 时可加入50%甲酰胺。

  1.3 无蛋白 展层技术 细胞色素C(Mr12 000)掩盖了DNA 分子的精细结构及其结合的蛋白 。Vollenweider等[5]用小相对分子质量的阳离子去垢剂苯二甲基苄基氯化胺(BAC,Mr350)取代细胞色素C,建立了无蛋白 展层技术(亦称BAC方法)。制备蛋白 质-DNA 复合物标本,先用甲酰胺配制2 mg/ml苯二甲基苄基氯化胺的贮存液,将1~2 mg/ml的DNA 用缓冲液或展开液稀释50倍,取20 μl在蒸馏水上展开。上述方法对技术条件变化敏感,下相液所用水必须为新蒸馏水或超纯水并经快速预冷。取样时最好用处理过的碳膜。处理方法有辉光放电[6]、溴化乙锭(EB)[7]、多聚赖氨酸(Mr2 000)及Alcian blue等。

  Thomas[8]用anthrabis取代细胞色素C,也建立了一种地蛋白 展层技术,认为对dsDNA 、ssDNA蛋白 质-DNA 复合体的制样效果优于BAC方法,该方法所用上相液中含有0.1 μg/ml的DNA 、0.01%的Anthrabis、30%的甲酰胺及缓冲液(pH8.5),经扩散方法取样。此外,SDS、EB及二价阳离子等亦曾用于无蛋白 制样技术。Griffiths对蛋白 质-DNA 复合体的电镜研究亦有详细描述[9]。

  1.4 低温电镜DNA 标本的制备 低温电镜(Gryoelectron microscopy)一直被认为是生物电子显微术中最有希望获得生物标本自然结构的手段。其理论基础是基于防止纯水或溶液经快速冷冻后冰晶的形成。水结冰有三种相变形式:常压下-70℃至-130℃形成三角形冰晶,-120℃至-140℃形成立方形冰晶,而-160℃以下形成无定形冰,即玻璃态冰。快速冷冻后DNA 样品中的水直接变为玻璃态冰,可以避免因形成冰晶造成结构损伤。在微筛支持膜上制备玻璃态含水的DNA 样品,加一套减少电子辐射损伤的电镜技术和相衬成相方法,可以获得高分辨率的近于自然状态的DNA 结构图像。该方法也避免了传统电镜制样时脱水、固定、吸附、染色、喷镀等处理对样品结构的破坏。其制样方法为:将3 μl的DNA 溶液(200 μg/ml)置于覆有微筛支持膜的铜网上,吸去多余液体,迅速将铜网浸入液氮预冷的液体乙烷中,经低温传输装置转移到冷冻样品台或储存于液氮中。为获得DNA 样品的高质量图像,要选择合适的微筛孔径及样品厚度,微筛的制备可用Murray建立的方法。

  1.5 试剂 细胞色素C和甲酰胺是DNA 电镜技术中最重要的试剂。不同型号的细胞色素C展开效果不同,有必要对不同的产品进行预试验,以选择最好的产品。为使DNA 电镜图象背景平滑、均匀,可用溴化氰(CNBr)将细胞色素C劈开[10]:将20 mg/ml细胞色素C,用1 ml0.1N HCl及30 mg溴化氰(CNBr)混匀,室温过夜处理,经Sephadex G50层析柱纯化。上相液中甲酰胺的质量对展开效果影响很大,应经纯化[11]或去离子处理[12]。

  1.6 支持膜[13] 细胞色素C展层技术中常用火棉胶膜,新制备的膜吸附性能及反差效果最好。无蛋白 展层技术使用碳膜最好,碳膜较稳定,污染小,但制备较火棉胶膜困难。低温电镜则需特殊的微筛支持膜。

  1.7 染色及喷镀 重金属染色及小角度旋转喷是增加DNA 分子反差的重要手段。染色一般用0.05 M HCl配制的0.05 M醋酸铀溶液,使用时用90%乙醇稀释1 000倍。金属喷镀常用钯铱合金,以7~10℃进行旋转喷镀,可使DNA 分子获得足够反差。

  2 长度测量

  DNA 电镜技术的显著优点是能从混合分子群体中显示单个DNA 分子的特征,并且利用电镜测量DNA 分子大小,常比其他方法更为准确。DNA 分子大小过去常用分子量(dalton)或碱基(bp)表示。1bp的DNA 约为(2.08±0.03)×106 daltons[14],相当于3.14 kb。根据电镜图像DNA 的长度,即可粗略计算其相对分子质量大小。样品在展开过程中展开力对DNA 的作用及测量误差会对测量结果产生影响。为排除这些因素的影响,制样时应加入已知相对分子质量的DNA 分子作为标准,根据长度比值,也可精确地计算出DNA 的长度大小。常用作标准的DNA 分子有SV40、pBR322、Φx174RFⅡ、fd DNA 等。线性DNA 分子一般不能用作标准。制样时加入已知浓度及大小的DNA 电镜下也可精确测定DNA 浓度。这些测定仅需5 μg DNA

  3 DNADNA 异源双链绘图

  异源双链方法可以检测不同类型DNA 分子间的同源序列。将两种DNA 分子进行碱变性或热变性后退火,同源序列部分杂交呈双链结构,非同源部分不能配对,在甲酰胺存在情况下维持双链状态,电镜下可显示三种结构特征:(1)除插入或缺失外,在两种DNA 分子均相同时,插入或缺失部分在双股异源双链分子中呈单链插入/缺失环;(2)两种相同的DNA 分子某一区域为其他序列取代,替代区域形成两股不能配对的单链(即替代环);只有小段DNA 相同时,则形成一短的双股区,两侧为不能配对的单链;(3)许多单个碱基不同的两种DNA 分子形成间隔异源双链含一系列单链及双链区,电镜下可以确定其位置及长度,能识别50~100 bp长的缺失/替代环。异源双链方法已成功用于噬菌体[15]及病毒[16]DNA 缺失、替代、插入、重复区域的定位及长度测量,阐明了爪蟾的rDNA 基因及间隔子的排列[17],发现了侧枝移动现象[18],确定了Ig可变区的编码区域[19]。

  4 标记方法

  细胞色素C及无蛋白 展层技术很难观察到结合于DNA 上的相对分子质量小于50 000的蛋白 ,也不能识别小于100 bp的DNADNA 或RNA∶DNA 杂交体。但如果将电子致密物铁蛋白 或胶体金标记到目的分子上再用传统方法制样即可解决此问题。

  铁蛋白 (Mr 900 000)具有电子致密核心,可以用化学方法直接偶联到核酸分子的3′末端[20]。由于铁蛋白 分子较大,会损害探针的生物特异性及结合活性,因此利用生物素-(链霉)亲和素的高亲和反应性,建立了间接标记方法。生物素(Mr244)比铁蛋白 小得多,可与亲和素[Mr 68 000]或链霉亲和素(Mr 68 000)高亲和力结合。生物素可以偶联到抗体和其他蛋白 上[21];生物素化核苷酸可以掺入核酸分子内[22]或加到RNA的3′末端。生物素化分子与偶联铁蛋白 的亲和素或链霉亲和素结合后即可在电镜下进行观察。利用此技术成功地进行了DNA 剪切修复区的观察[23]及DNA 末端标记,并对Ad2、Φ290噬菌体DNA 的末端蛋白 进行了观察。用铁蛋白 标记观察到SV40的T抗原结合位点及SV40DNA 复制起始区。抗原-抗体反应使DNA 结合蛋白 的信号特异性增强,单抗技术及电子致密物标记抗体的问世加速了此反应在标记技术中的应用。此外,Wu及Davidson[24]建立了一种DNP-抗-DNP方法标记DNA 结合蛋白 。首先,二硝基氟苯与DNA 结合的蛋白 反应,二硝基苯酚(DNP)及抗原结合到蛋白 的氨基基团,再与抗DNP抗体反应,尔后结合铁蛋白 或胶体金标记的抗IgG;也可结合生物素化抗IgG或生物素化SPA,再与偶联蛋白 或胶体金(链霉)亲和素结合。此法对Ad2 DNA 末端蛋白 的标记率可达78%。样品可以用细胞色素C展层技术制备,并且经过双重标记可以在电镜下观察到相对分子质量小于6 000的蛋白

  5 活性基因观察

  1969年Miller等[25]建立了染色体展层技术,尔后应用于原核及真核系统核糖体基因体内转录的观察[26],首次在电镜下观察到真核活性转录基因的染色体结构。首先从核仁中分离大部分核仁蛋白 ,获得核仁染色体成分rDNA 染色质,用于阐明前rRNA基因初级转录单位的基本结构排列。基因区在电镜下为以DNA 为轴心的DNA -蛋白 细丝,被RNA聚合酶分子覆盖,约有100多个同时转录的RNA聚合酶颗粒。聚合酶颗粒在基因5′端(转录起始部位)及3′末端(转录终止部位)有明显的界限。随着转录进行,新生的互补RNA转录不断延长,并形成特定的构象,在转录终止部位呈复杂的核糖核蛋白 (RNP)细丝结构。因此,Miller染色体展层技术获得了有关基因功能的重要的形态结构资料。有关核仁分离及电镜样本制备技术及改进,Trendelenburg等进行了详细描述。

  电镜下可观察克隆的真核基因在异种系统内的表达。将含有昆虫rRNA基因的环形DNA 注入蛙卵母细胞,展开制样后电镜下有可能识别注入的DNA 上的起始转录并进行特异性分析;注入环状DNA 有助于确定观察到的转录复合体是起源于注入的DNA 抑或是内源性DNA 。腺粒体DNA 也能装配成染色质样结构,那么它很有可能成为分析克隆的单拷贝基因转录活性、初级转录物的结构及其加工的有力工具。

  6 RNA∶DNA 杂交及R-环绘图

  RNA与DNA 分子内的互补序列杂交包括两种情况:一是RNA与完全变性的DNA 杂交,另一种是在近于DNA 的解链温度(Tss)下与部分变性的DNA 互补序列杂交。在70%以上甲酰胺浓度条件下,RNA∶DNA 杂交体比DNADNA 杂交体更稳定,DNA 复性后,RNA杂交处的序列不能复性而呈“眼”形R-环结构。

  该技术的应用大致概括以下方面:显示RNA转录区域位置及长度,确定转录方向。Roberts及Sharp应用此技术在观察Ad2 mRNA与其DNA 片段杂交分子时发现断裂基因的存在,导gcft致全新的分子生物学观点,并因此获得1993年诺贝尔生理和医学奖。在获得cDNA 克隆后,可用此技术对相关病毒RNA进行标位。RNA∶DNA 杂交体可显示多种RNA是否从相同或不同DNA 链转录而来;R-环技术也可对体外转录及限制性内切酶位点进行分析。

  7 蛋白 质-DNA 相互作用

  电镜下可对结合于特异核苷酸序列的蛋白 进行快速定位,而对蛋白 质-DNA 复合体的结构分析则较为困难,必须排除样品制备过程产生的假象。制样技术对条件变化非常敏感。蛋白 质与DNA 的结合可以是特异性的,如酶及转录调控蛋白 ;也可以是非特异性的,如组蛋白 等。蛋白 质-DNA 复合体样品常用BAC方法制备,由于标记技术的应用,也可用细胞色素C技术进行制样。低温电镜技术则须用特殊的制样方法。

  首先各种酶与DNA 结合的研究,初期研究最多的是RNA聚合酶与噬菌体DNA 启动子部位。与转录绘图方法相比,结合位点有许多不足,不能将激活转录的结合位点与其他结合位点区分开。有些启动子位点能有效起始转录,但不形成稳定的复合体;而强结合部位不一定能有效起始转录。最近利用低温电镜技术对RNA聚合酶与超卷曲DNA 分子结合在转录中的作用进行了研究,并与传统电镜方法进行了比较。研究较多的另一种蛋白 是λ抑制子与操纵子DNA 的结合,可以观察到抑制子四聚体的亚单位[27]。此外,在阐明限制性内切酶与底物DNA 相互作用的复杂方式方面也做了大量工作。电镜下直接观察到λ及pML DNA 上的特异性限制酶切位点,加入ATP会使限制内切酶发生构象变化。这种构象变化反映在酶的大小上,其直径从1.6 nm降至于1.2 nm, 但不能确定这种变化的原因。EcoRⅠ是研究最多的内切酶之一,其相对分子质量为31 000,276个氨基酸,除与特异识别序列结合外,在镁离子存在下也能发生非特异性结合,这种非特性结合可能有利于EcoRⅠ沿DNA 分子扩散而形成特异性DNA -EcoRⅠ复合体[28]。近来对拓扑异构酶与DNA 结合的日益增多,Wong等用电镜观察到拓扑异构酶抑制剂可以使腺病毒双链基因组在特定区域形成单链及双链DNA 片段,并且在感染后期,腺病毒DNA 排列成拓扑结构紧密的环状结构区域,证实在线性腺病毒基因组的复制、转录及包装中拓扑异构酶起重要作用。拓扑异构酶与DNA 相互作用受DNA 结构的影响,它主要在DNA 弯曲-非弯曲连接处结合。利用电镜还发现解旋酶的作用是在其结合链上以5′→3′方向进行解链。

  最近应用电镜技术研究较多的病毒DNA 结合蛋白 有SV40T抗原,EB病毒核心抗原(EBNA-1),λ噬菌体0蛋白 ;另外对高动族(HMG)蛋白 [29]、RecA蛋白 [30]等的电镜研究日益增多。

  制备蛋白 质-DNA 复合体电镜样品时标本的固定非常重要,一般用0.1%戊二醛固定。固定后的复合体比较稳定,可以经亲和层析与未结合的蛋白 分离。Spiess等对核酸-蛋白 质的制备及电镜观察有详细描述。

  8 结束语

  DNA 电镜技术自1959年Kleinschmidt等首次成功地观察到双链DNA 分子以来发展迅速,目前已经建立了一系列方法[31]用于对基因排列进行定量及定性分析。综合运用这些技术可以解决许多分子生物学中的问题。标记技术的发展及低温电镜技术的应用,克服了传统制样技术中的某些缺陷,使DNA 电镜技术的应用更加广泛,大体可以概括如下:(1)观察DNA 结构特征;(2)观察复制中间体等复杂结构;(3)分析核酸分子之间的同源互补序列;(4)研究蛋白 质-DNA 相互作用。

  电镜技术的基本优点为:标本用量小,制样速度快,一般数小时内即可获得定量资料,提供关于DNA 的重要结构域、基因组排列、蛋白 质-DNA 复合体特征的直接资料,弥补分子生物学研究方法的不足。

  参考文献

  1 Kleinschmidt AK, Zahn RK. Ueber Deoxyribonucleinsaure-Molekeln in Protein-Mischfilmen, Z Naturforsch, 1959,14b:770-776.

  2 Brack C. DNA electron microscopy. CRC Critical Reviews in Biochemistry, 1981, 10:113-169.

  3 Coggins LW, Trendelenberg MF, Zentgraf H, et al. Preparation of nucleic acids for electron microscopy. In: Electron Microscopy in Molecular Biololgy, a Practical Approach. Sommerville J, Scheer U, eds. IRL Press, Oxford, Washington DC, 1987, 1-60.

  4 Lang D, Mitani M. Simplified quantitative electron microscopy of biopolymers. Biopolymers, 1970,9:373-378.

  5 Vollenweider HJ, Sogo JK, Koller T. A routine method for protein-free spreading of double-and single-stranded nucleic acid molecules. Proc Natl Acad Sci U S A, 1975, 72:83-88.

  6 Griffith JD. Electron microscopic visualization of DNA in association with cellular components. In: Methods in Cell Biology, Vol.7, Precott PM, eds. Academic Press, New York, 1972,129-138.

  7 Broder TR, Anger LM, Yen PH, et al. Electron microscopic visualization of tRNA genes with ferritin-avidin: biotin labels. Nucleic Acids Res, 1978,5:363-384.

  8 Thomas JO. Electron microscopy of DNA . In: Principles and Techniques of Electron Microscopy. Hayat MA, eds. Van Nostrand and Reingold, New York, 1978, 9:64-96.

  9 Griffith JD, Christiansen G. Electron microscopic visualization of chromatin and other DNA -protein complexes. Annu Rev Biophys Bioeng, 1978, 7:19-25.

  10 Delius H, Wesphal H, Axelrod N. Length measurement of RNA synthesized in vitro by Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol, 1973, 74:677-683.

  11 Robberson D, Aloni Y, Attardi C, et al. Expression of the mitochondrial genome in Hela cells. VI. Size determination of mitochondrial ribosomal RNA by electron microscopy. J Mol Biol, 1971, 60:474-480.

  12 Mmaniatis T, Jeffrey A. China length determination of small double-and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochm, 1975, 14:3787-3793.

  13 Baumeister W, Hahn M. Specimen supports. In: Principles and Techniques of Electron Microscopy. Vol. 8, Hayat MN, eds. Van Nosteand Reinhold, New York, 1978, 1-33.

  14 Out P, Schatz C. Electron microscopic visualization of nucleic acid hybrids. In: Nucleic Acid Hybridization, a Practical Approach. Hames BD, Higgins SJ, eds. IRL Press Oxford, Washington DC, 1987,161-182.

  15 Davis RW, Simon M, Mamet-Bratley MD. Electron microscope heteroduplex method for mapping regions of base sequence homology in nucleic acids. Methods Enzymol, 1971, 21:413-420.

  16 Mertz JE, Herzberg M, Davis RW, et al. Isolation and characterization of individual clones of simian virus 40 mutants containing deletion and insertions in their DNA . Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol, 1974, 39:69-78.

  17 Wellauer PK, Reeder RH, David IB, et al. The arrangement of length heterogencity in repeating units of amplified and chromosomal DNA from Xenopus laevis. J Mol Biol 1976, 105:487-494.

  18 Lee CS, Davis RW, Davidson N. A physical study by electron microscopy of the terminally repetitions, circularly permutes DNA from the coliphage particles of Escherichia coli 15. J Mol Biol 1970, 48:1-8.

  19 Hozumi N, Brack C, Pirrotta V, et al. Characterization of a mouse DNA clone containing an immunoglobulin variable gene. Nucleic Acids Res, 1978, 5:1779-1784.

  20 Wu M, Davidson N. A technique for mapping transfer RNA gene by electron microscopy of hybrids of ferritin-labeled transfer RNA and DNA :the Φ80 hpsu; m-system. J Mol Biol, 1973, 78:1-6.

  21 Richards OC, Ehrenfeld E, Manning J. Strand-specific attachment of avidin-spheres to double-stranded poliovirus RNA, Proc Natl Acad Sci. U S A, 1979, 76:676-681.

  22 Sodja A, Davidson N. Gene mapping and gene enrichment by the avidin-biotin interaction: use of cytochrome-C as a polyamine bridge. Nucleic Acids Res. 1978, 5:385-391.

  23 Hunting DJ. Incorporation of biotin-labeled dUTP into DNA during excision repair and electron microscopic visualization of repair paths. Biochemistry, 1985, 24:5729-5734.

  24 Wu M, Davidson N. An electron microscopic method for the mapping of proteins attached to nucleic acids. Nucleic Acids Res, 1978,5:4711-4715.

  25 Miller OL, Beatty BR. Visualization of nucleolar genes. Science, 1969, 164:955-1001.

  26 Miller OL, Bakken AH. Morphological studies of transcription. Acta Endocrinol. (Copenhagen)Suppl. 1972, 168:155-160.

  27 Brack C, Pirrotta V. Electron microscopic study of the repressor of bacteriophage λ and its interaction with operator DNA . J Mol Biol 1975, 96:139-145.

  28 Schnos M, Zahn K, Blattner FR, et al. DNA looping induced by bacteriophage λ protein: Implications for formation of higher order structures at the λ origin of replication. Virology, 1989, 168:370-377.

  29 Stros M, Stodrova J, Thomas JO. DNA looping by the HMG-box domains of HMG and modulation of DNA binding by the acidic C-terminal domain. Nucleic Acids Res 1994, 22:1044-1051.

  30 Threasher RJ, Griffith JD. Intercalators promote the binding of Rec A protein to double-stranded DNA . Proc Natl Acid Sci U S A 1990, 87:5056-5060.

  31 龚祖涡.生物高分子的电子显微镜研究和标本制备技术.见:洪涛,主编.生物医学超微结构与电子显微镜技术.北京:科学技术出版社,1980,269-279.

 

<center> <p>  </p> </center>
上一篇:用于基因治疗的慢病毒载体   下一篇:抗原呈递过程中病毒免疫逃避的研究进展
提问
扫一扫
丁香实验小程序二维码
实验小助手
丁香实验公众号二维码
扫码领资料
反馈
TOP
打开小程序