引物合成介绍-2
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引物合成介绍
5.需要什么级别的引物？
答：引物常用的纯化方式C18脱盐，OPC纯化，PAGE纯化，HPLC纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用 引物长度要求 纯度级别要求
一般PCR扩增 < 45base OPC
>45 base PAGE
诊断PCR扩增 < 40base OPC, PAGE
DNA测序 20base左右 OPC
亚克隆，点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGE，HPLC
基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 PAGE
反义核酸 根据实验要求定 PAGE
修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC
6.最长可以合成多长的引物？
答：引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过120base的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过80mer,按照目前的引物合成效率，80mer的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过40%，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
7.需要合成多少OD数？
答：根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
8.如何检测引物的纯度？
答：实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M 尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95℃ ,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用EB 染色或银染方式染色。
9.如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成10-50pmol/ul。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成50pmol/ul，加水的体积（微升）按下列方式计算：V (微升)= OD数（乘）33 *（乘）（乘）20000 / (除) 引物的分子量。引物的分子量可以从合成报告单上获得。如果需要配制成其他浓度，按上述公式换算。
注意：1 OD260= 33 ug/ml.
10.如何计算引物的Tm值？
答：引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃ (G + C)+ 2℃ (A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) � 600/size
公式中，Size = 引物长度。
Tm的定义：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.
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