蛋白质组研究MALDI常见问题

1. 怎样邮寄我的样品？
冻干的胶或干粉可以直接邮寄。切胶后的湿胶（不用做任何处理），放在 EP 管中 ( 不加任何缓冲液 ) ；用干冰速冻；邮寄时，置样品于足够的干冰中。液体样品的邮寄方式同湿胶一样。

2. 为什么要使用内标？
用内标做校准可以大大减少 MALDI-MS 的误差（ <70ppm ），从而提高查库结果和可靠性。好的内标肽段需要有以下的要求：最好有两个肽（两点一线）；质量不要在大多数的肽段范围内（ 1200 ～ 2500 Da ）；内标的量要与样品的量成比例；内标对其他肽段离子化的抑止要小。我们实验室使用的内标是 25fmol 的——和——。不过，一般情况下，使用外标做校准也可以达到比较满意的数据（ <150ppm ）。所以，顾客可以根据自己的需要来选择是否使用内标。

3. 我为什么还要提供正负空白胶正对照提供 (exact) 对照两块胶？
正负对照的两块胶是用来对整个鉴定过程做质量控制的。负对照（空白胶）主要是看样品是否有污染（比如角蛋白的污染）；正对照（已知胶，比如同一块胶上的标准蛋白）主要是检测酶解和质谱的效果是否正常。如果客户不能提供正负对照，我们可以使用自己预先准备的胶条。如果顾客的样品量大（ >10 个 2D 胶上的点），则顾客必须提供正负对照。

4. 对于胶上蛋白质的鉴定，我应该提供多少蛋白质？
一般情况下，考染能看得见的点都有机会鉴定出来。分子量在 2 － 5 万之间的蛋白质，鉴定成功率一般比较大。分子量小的蛋白酶切位点少，合适的肽段（ 1000 ～ 3000 Da ）就少，所以鉴定的成功率相对较低。而分子量太大的蛋白质，在同等质量的情况下，蛋白的摩尔数 (pmol) 较少；而且查库时匹配肽段的覆盖率会比较低（因为整个蛋白质较大），从而影响鉴定的成功率。

5. 为什么我的 MALDI 图谱中都是相差 44Da 的峰，肽段的峰则全被抑制了？
相差 44Da 的峰可能是 Triton X 峰 ，也可能是 polymer （ -CH2CHOH- ）峰。这些 polymer 是从 EP 管的内壁沥滤（ leaching ）出来的。所以 样品中不能含有 Triton X 。 另外实验中不能使用加有可塑剂（ plasticizer ）或塑料软化剂的离心管（比如 PCR 管）来装取样品。最好是使用进口 EP 管。另外，可以用 60 ％的乙腈 /0.1%TFA 去清洗 EP 管的内壁以防沥滤。清洗后，要等到残留液都挥发（ air dry or speed vac ）后再装样品。 此过程中要注意不让杂质灰尘落入管内。 另外，试验操作过程中所佩戴的塑胶手套也可能有可塑剂。所以一定要佩戴无尘的手套。每次用手打开或触摸盛有样品的 EP 管时，一定注意不要碰到 EP 管盖的内壁。开盖时，可以使用 Eppendorf 枪上的金属拉杆（动作如开啤酒瓶盖儿）。从冻干机中取出 EP 管时，最好拿在盖子和管子的连接部分或盖子的突出部分。胶的染色和脱色中，尽量不要触摸胶（即便是带了手套）。可以用厨房用的铲子（带镂空的那种，超市里有卖）来操作。

6 ．各种去垢剂对 MALDI 有何影响？
离子型去垢剂对 MALDI 的影响要比非离子型去垢剂大。去垢剂浓度越高，影响越大。
在浓度为 1.0% (w/v) 时 : 除了一些糖类的非离子型去垢剂，大部分去垢剂会把蛋白质的信号减低 10 倍。
At 0.01% detergent concentration (w/v): 只有 SDS 和牛磺胆酸影响信号。但它们会使信号减低超过 20 倍。
在浓度为 0.1% (w/v) 时 : 不同的去垢剂对信号的影响差别比较大。具体效果见下 表。信号指有去垢剂时的信号和无去垢剂时的信号之比。

7 ． 为什么我的 MALDI 图谱中都是相差 111Da 的峰？
有可能样品在超虑时接触了聚砜树脂（ polysulfone ）的膜。 Polysulfone 有四个峰。各个系列的峰之间相差 111Da 。

8. 怎样避免角蛋白的污染？
常见的角蛋白有四种，主要是从皮肤屑（直接接触）和头皮屑（空气传播）中来的。质谱中 检测到的角蛋白峰应该是在酶解前就进入样品中来的（主要是在染胶，脱色，切胶和加酶这四步）。试验中一定要佩戴手套；一定要仔细清洗染胶的容器（先用 70 ％酒精洗，再用去离子水洗）；切胶要带口罩，并在通风橱中进行。另外，从来源于实验操作人员穿着的毛衣中的羊的角蛋白也被检测到过，所以试验中要穿试验服。

9 ． MALDI 检测时，有那些常见的角蛋白峰？
质谱中常见的角蛋白峰有：
1319.575, 1349.679, 1474.741, 1474.777, 1656.785, 1706.742, 1715.843, 1739.697, 1790.719, 1838.984, 1889.849, 1992.969, 2090.874, 2285.116, 2382.943, 2399.203, 2500.059, 2509.123, 2650.381, 2704.152, 2830.185, 3222.272, 3223.368, 3311.299

其中最常见，强度又高的有 ( 按强度排列 ) ：
1. 2382.9
2. 1706.7
3. 2704.1
4. 3311.3

这些数据是从多次实验中总结得来的，实验条件不同，可能会得到不同的结果。

10. 单一同位素肽段质量（monoisotopic peptide mass）和平均同位素肽段质量（average peptide mass）有什么不同？
组成蛋白质的原子在自然界中存在着不同比例的同位素（见下表）。所以含有这些同位素原子的肽段的质量比不含任何同位素的肽段的质量要大。不含任何同位素的肽段的质量叫单一同位素肽段质量；同一种肽段所有的同位素形式（包括含同位素的，也包括不含同位素的）的质量的平均数叫平均同位素肽段质量。

11. 怎样在质谱的图谱上确定单一同位素峰和平均同位素峰?
在分辨率低的质谱图谱上，所显示的峰一般是平均同位素峰。但目前常用的质谱方法（比如 MALDI-TOF ）分辨率一般都很高，一般的小分子（比如肽段）常含有 4 到 5 个同位素峰，其中分子量最小的那个就是单一同位素峰。但是，当用质谱检测大分子（比如完整蛋白质）时，同位素峰的数目很多，难以在图谱上区分。在这种情况下，使用平均同位素质量会比较更有意义。

12. 同位素峰之间一定是相差 1 Da 吗？
同位素肽段的质量（ m ）一般是相差 1 Da ，但因为质谱检测到的峰是肽段的质荷比（ m/z ），而不是质量本身，所以在肽段带有多个电荷的情况下，其质荷比相差要小于 1 。如果检测到的肽段带一个电荷，那同位素峰之间是相差 1 ；如果检测到的肽段带两个电荷，那同位素峰之间便相差 0.5 ；如果检测到的肽段带三个电荷，那同位素峰之间便差 0.33 ；以此类推。所以从同位素峰之间的间距，可以推断出肽段的带电情况（ z ），从而推断出肽段的单一同位素质量 [(m/z~undefinedz] 。

13. 哪种离子化方式产生的肽段易带多个电荷？
在蛋白质组学所涉及的质谱技术中，常见的离子化方式有 MALDI 和 ESI 。目前，对这两种方法的原理和离子化的具体细节还没有一个公认的阐述。但经验表明， MALDI 所产生的离子化肽段只带一个电荷（正离子方式）。而 ESI 所产生的离子化肽段往往带有多个电荷。

14. 单一同位素峰一定是最高的峰吗？
单一同位素峰一定是一组峰里面质荷比最低的，但不一定是最高的。当肽段的分子量较小时，其所含的原子总数也少，所以整个肽段含有同位素原子的几率也比较小。这时，单一同位素峰往往是最高的峰。当肽段的分子量增大时，其带有同位素原子的几率也随之增大。在这种情况下，＋ 1 Da ，甚至＋ 2 Da 的同位素峰有可能成为最高峰。统计表明，当肽段的分子量超过 2500 Da 时，最高峰往往不是单一同位素峰。

15. 单一同位素峰的鉴定有什么意义？
单一同位素峰的鉴定对后续的查库工作有重要意义。质谱法鉴定蛋白质一般是把得到的质核比数据和数据库里的数据比对。所以，如果所采集的数据里混有不是单一同位素峰的质量，那么就有可能在查库时找不到目标蛋白质，或是找到其他的蛋白质，从而严重影响比对的效率和真实性。

16 ．氨基酸有那些常见的修饰？各种修饰对分子量的改变是多少？
氨基酸常见的修饰。氨基酸所有的修饰.