基因的化学合成

化学法主要适用于已知核苷酸序列的、分子量较小的目的基因的制备。在基因的化学合成中，通常是先合成一定长度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的化学合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法，以及在后者基础上发展起来的固相合成法和自动化法。

 

 

 

磷酸二酯法

 

基本原理是将一个 5 ’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸与另一个 3 ’端带有适当保护基的脱氧单核苷酸偶联起来，形成一个带有磷酸二酯键的脱氧二核苷酸分子。

 

 

 

亚磷酸三酯法

 

原理是将所要合成的寡核苷酸链的 3 ’末端先以 3 ’ -OH 与一个不溶性载体，如多孔玻璃珠连接，然后依次从 3 ’ -5 ’的方向将核苷酸单体加上去，所使用的核苷酸单体的活性官能团都是经过保护的，其中 5 ’ -OH 用 4,4- 二对甲氧基三苯基保护， 3 ’ - 端的二丙基亚磷酸酰上的磷酸的 OH ，用甲基或 ? 氰乙基保护。

 

寡核苷酸连接法

 

目前，化学合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于 150-200bp ，而绝大多数基因的大小超过了这个范围，因此，需要将寡核苷酸适当连接组装成完整的基因。

 

 

 

常用的基因组装方法主要有两种：

第一种方法是将寡聚核苷酸激活，带上必要的 5 ’ - 磷酸基团，然后与相应的互补寡核苷酸片段退火，形成带有粘性末端的双链寡核苷酸片段，再用 T4DNA 连接酶将它们彼此连接成一个完整的基团或基团的一个大片段。

第二种方法是将两条具有互补 3 ’末端的长的寡核苷酸片段彼此退火，所产生的单链 DNA 作为模板在大肠杆菌 DNA 聚合酶 Klenow 片段作用下，合成出相应的互补链，所形成的双链 DNA 片段，可经处理插入适当的载体上。