DNA合成在基因工程和分子生物学研究中的应用

互联网2013-11-15

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合成基因
目前有许多基因和蛋白质的核苷酸和氨基酸序列已得到阐明，人们已经可以根据需要合成出具有实际应用和研究价值的多肽和蛋白质基因。已报道的合成基因有人生长激素、干扰素、胰岛素、表皮生长因子、白细胞介素 II 、集落刺激因子等，绝大多数已在原核和真核系统中获得表达。

合成基因的方式
1 全基因合成：
分子较小而又不易得到的基因采用该方式。
将双链基因分成若干寡核苷酸单链片段 ( 尤其待合成基因在 100 个核苷酸以上时 ) ，每个片段长度控制在 40 ～ 60 个碱基，并使每对相邻互补的片段之间有 4 ～ 6 个碱基交叉重叠。
在体外将除基因两端末端外的所有片段磷酸化。混合退火后加入 DNA 连接酶，即可得到较大的基因片段。
2 酶促合成：
又称基因的半合成。全基因，特别是较大的基因的全部化学合成成本昂贵，使用半合成的方法可以降低成本，从而利于普及使用。
首先合成末端之间有 10 ～ 14 个互补碱基的寡核苷酸片段，退火后以重叠区作为引物，在 4 种 dNTP 存在的条件下，通过 DNA 聚合酶 I 大片段 (Klenow 酶 ) 或反转录酶的作用，获得两条完整的互补双链。

合成探针
人工合成的具有特定顺序的寡聚 DNA 片段，已应用于筛选和鉴定重组质粒或 λ 噬菌体。实验证明用合成的寡核苷酸片段，即使只有 1 对碱基错配采用严谨条件杂交也能与完全互补的双链相区别。

合成引物
1. 合成 PCR 引物进行基因扩增
PCR 技术是 80 年代中期发展起来的一种体外扩增特异 DNA 片段的技术。该法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万特异 DNA 序列拷贝。 PCR 技术的特异性取决于所用引物和模板 DNA 结合的特异性。　
2. 序列测定用引物
DNA 序列测定是分子生物学中最重要和最精细的研究技术，其中最常使用的是末端终止法，即是一种依赖于特异 DNA 引物的序列测定方法。
3. 合成导入突变用的引物：
利用寡核苷酸引导的突变，可在目的 DNA 序列的任何部分产生点突变、插入和缺失，从而使得基因编码的蛋白质在结构和功能上发生改变。

合成连接子和接头
在 DNA 重组中常需要将外源 DNA 片段插入某些载体 DNA 中。如果载体或外源 DNA 上没有合适的限制性内切酶位点，为提高插入效率或实现定向克隆，可采用合成连接子 (linker) 和接头 (adaptor) 的方法。

合成基因在医学中的应用
许多疾病，如遗传性疾病、肿瘤、心血管疾病等可在基因结构上找到某些变化，如基因的缺失、突变、转位，以此作为证据可对这些疾病作同相应的判断。
目前，合成 DNA 探针已广应用于临床，成为一种有效的诊断手段。

1 用于遗传病的诊断
过去仅有少数遗传性疾病可以凭借蛋白质和酶学方面的异常作出判断，随着分子生物的发展，对遗传病的诊断有了巨大的进步，出现了基因诊断法。
例如镰刀状细胞贫血症即是由于A→T突变造成β-珠蛋白第六位谷氨酸变为缬氨酸，从而造成珠蛋白结构异常，并引起红细胞形态及对氧的亲合力发生改变。
2 用于传染病的诊断
临床上对传染性疾病的传统诊断程序常常是检测病原体及其抗体，需时较长，达不到早期诊断的目的。
合成探针在传染病特别是由病毒感染性所致的传染病检测中，已得到广泛应用，尤其是结合PCR方法使诊断的灵敏度可进一步提高，目前国内已制出检测乙肝病毒、艾滋病病毒(HIV)、轮状病毒和疱疹疾病等多种基因探针诊断试剂盒。