大分子导入细胞技术

大分子导入细胞技术

外源核酸、多肽导入受体细胞的方法繁多，大致可分为三类：化学方法、物理化学方法和生物学方法。化学方法常见的有磷酸钙沉淀法、DEAE葡聚糖转染法、脂质体转染法和PEI介导转染法等；物理方法有电穿孔法，基因枪粒子轰击法等；生物学方法中，目前主要是利用病毒作为外源核酸、多肽导入的工具，通过病毒感染将外源核酸、多肽导入受体细胞内。

实验　 细胞显微注射技术

[实验目的]
1 了解细胞显微注射的基本原理
2 掌握细胞显微注射基本技术

[实验原理]
显微注射技术是利用显微操作系统和显微注射技术将外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受体细胞的基因组内，再通过胚胎移植技术将整合有外源基因的受精卵移植到受体动物的子宫内发育，从而获得转基因动物。它是目前基因转移效率较好的一种基因转移方法，可直接用不含有原核载体DNA片段的外源基因进行转移；外源基因的长度不受限制, 可达100kb ；实验周期相对比较短。它的不足之处是：需要昂贵精密的设备；显微注射操作复杂，需专门技术人员；导入外源基因整合位点和拷贝数无法控制；常导致插入位点附近宿主DNA 片段缺失、重组等突变，可造成动物严重的生理缺陷。尽管如此，由于显微注射技术直接对基因进行操作，整合率较高，因而仍是目前建立转基因动物极为重要的方法。
显微注射技术在植物、动物的细胞发育研究的应用，为研究体内生理和体外的生化过程架起桥梁，将特定的分子探针及衍生的细胞间质成分导入活体细胞，为研究控制细胞功能的调控机制提供了新的视野。

[仪器、材料和试剂]
（一） 仪器和用具：
倒置显微镜（如Nikon TMS 和Diaphot 300/2；Zeiss Axiovert 100或135，或Axioskop FS）；
Leitz重型基座（用于安放显微镜和微操作仪）；
微操作仪：Leitz（手动系统，安在平台上）或Eppendorf 5171（自动轴向微注射系统，可固定在显微镜的载物台上）；
微注射器：Eppendorf 5242，也可选用螺旋推柄的玻璃注射器。
拉针仪：水平拉针仪P87型（如Sutter Instrument Co.(Novato,USA)），或垂直拉针仪720型（如David Kopf Instruments(Tujunga,California,USA)。
玻璃注射针头：可购买厂商拉制好的商品，也可用拉针仪自行拉制（可参照[方法与步骤]中的1.1注射针头的拉制）。
细胞培养设备：细胞培养箱、超净工作台、塑料平皿和盖玻片等。
（二） 材料：
（三） 试剂：
缓冲培养基（含25mmol/L HEPES pH7.2）；注射缓冲液（10mmol/L H2PO4-和HPO42-，pH7.2，84mmol/L K ，17mmol/L Na ，1mmol/L EDTA）

[方法与步骤]
1． 材料准备
1.1 注射针头的拉制
水平拉针仪：装上一根毛细管，拧紧左右两侧的夹子，做好固定，并使其中间部位对准加热丝。设定好电流、拉力和时间。然后按开始键，等待毛细管被拉成两个所需的微注射针头。
垂直拉针仪：把玻璃毛细管固定在上面的夹子上，使其对准加热丝后旋紧。抬起下面的滑夹，固定在毛细管上。调整热度和螺线管范围。
使用拉针仪自行拉制的微注射针头，最好使用硼硅酸盐玻璃的毛细管。可以采用硅烷对注射针头进行处理，以防样品和培养基成分与玻璃的亲水表面相互作用，从而引起针尖阻塞而影响注射。
1.2 盖玻片的处理
1 把盖玻片放在陶瓷或金属架上，相互不要接触。
2 在装有自来水的烧杯中，快速浸泡和冲洗。
3 在纸巾上把架子控干，再放入盛有0.1mol/L HCl的烧杯中，温育过夜。
4 用自来水冲洗盖玻片，每次10min，共5次。
5 把架子浸入70%的乙醇中，温育60min。
6 用去离子水短暂冲洗，放在纸巾上控干。
7 在室温下自然干燥30min。
8 在220～250℃烤6 h。
1.3 显微注射用细胞的准备
1 在注射前一天，把细胞铺到直径为10～15mm的盖玻片上，每个盖玻片250～1000个细胞。
2 在注射前，把带有需要注射细胞的盖玻片转移至新的组织培养皿中，迅速用金刚石笔在盖玻片上划一个十字或一个圆圈标记（金刚石笔使用前用70%乙醇冲洗，并在超净台中用火焰烧一下），然后加入3ml有缓冲液的培养基。

2．显微注射操作过程
2.1　针头装液
1　使用无菌的微量加样器从微注射针头的后部加入0.5～1μl的注射样品。
2　使用玻璃毛细管拉出毛细管针头，里面有与毛细管平行的细丝，有利于液体从后部向针头方向运动。只需在针头后部浸入1mm深度，不需使用手指或其他东西接触，就足以使少量的样品到达针尖部。
2.2　针头定位
1　将装液后的针头的游离端安在连接器上，然后旋紧连接器以固定针头，再将其固定到微操作仪的托针管上。
2　把载有待注射细胞的盖玻片转移到里面有缓冲培养基的平皿中，将其放在中央。
3　将培养皿放在显微镜载物台上，尽量将盖玻片上所画圆圈的一个对准光照的中心区，这时光的亮度最好。
4　用低倍物镜对准细胞调焦。
5　将针头推入视野中心，在视野中针头呈阴影状。
6　轻轻的落下针头，直至到达培养基中后停下。
7　通过显微镜观察，移动针头，必要时调整微操作仪，直到针头的阴影在视野的上方。然后确定针头的位置，使其约处在视野中心。
8　轻轻下调针头，直到针头变得清晰一些
2． 调到工作放大倍数，调准细胞焦距，找到针尖。
3． 如果找不到，重新使用低倍镜，尽量将针头调到视野的中心，重复上述的步骤。
10　小心下调针尖，直到其完全聚焦。
1.3 显微注射的操作
2.3.1　手动细胞核内注射
1 使用最低放大倍数（50×），把焦距对准位于盖玻片上注射标记区域的细胞平面上。用肉眼将注射针头对准到照度最亮处的中心，降下针头，直到进入培养基。把针头调入到视野的中心，轻轻放下针头，直到看清楚为止。然后将放大倍数调至工作倍数，即320×，对准细胞表面调焦。将针头调整到中心，下降针头，对准焦距。移动显微镜载物台，使针尖对准细胞核或核周的胞质。
2 小心落下针尖，使其进入细胞核或核周的胞质。
3 使用注射器施加注射压
4 轻轻上提针头，直到离开细胞。
5 移动显微镜载物台，找到下一个细胞，重复2～4步骤。
2.3.2 自动细胞核内注射和细胞质内注射
1 按上述手动系统的方法将针头调整至视野中间，不同的是通过控制面板自动控制微操作部分。
2 工作放大倍数为320×，下降针头，使之触及细胞核或核周间隙上方的细胞表面，直到细胞表面见到一个轻微的压迹。
3 通过控制部分，设定细胞核内或细胞质内注射的定位参数。
4 将针头略提起，离开细胞表面几微米，选择一个新细胞，按下操纵杆上方的按钮进行微注射。针头首先在水平面上做逆向轨迹运动，然后朝向细胞做出一个迅速的轴向运动，正好刺入细胞内预先设定好的坐标位置，这时微操作仪的控制部分，激活注射压力，持续时间已经预先设定好。针头回到原来的位置。
5 在必要的情况下，可以在控制面板上修正各种参数，因为盖玻片和平皿的表面不是十分平整，所以当从盖玻片的一个地方移动到另一个地方进行注射时，一定要重新调整细胞核内或细胞质的坐标。

3　对注射了荧光标记物的细胞的分析
荧光标记物，如FITC-葡聚糖等常用来作注射用标记物，以分辨出已经注射的细胞。浓度为0.25%～1%时，这种物质的毒性很小，而且在细胞增殖的2～4天仍可见。
3.1 在PBS中轻轻冲洗注射过的细胞两次。
3.2 用甲醇（2min）或PFA/GA（5min）快速固定
3.3 用去离子水快速冲洗盖玻片。
3.4 滴一滴Mowiol，将盖玻片装到载玻片上。

[注意事项]
1 在整个过程中，注射针尖应远离人员和实验室中的仪器。注射针在持针器上安装不牢时，注射器、管子及注射针内的压力，可能将注射针射出。
2 在反向充填液体时，适当地在显微镜下观察注射针尖，以决定在加压时是否注射针阻塞或偏斜。阻塞通常可通过将针尖轻轻敲击一个固定物而得以缓解。针尖偏斜的注射针是适合于显微注射的，但其使用应做细微调整或补偿注射中加压所造成的额外偏斜。
3 注射速度过快能扰乱细胞质成分，细胞裂解或细胞从底层移位。当注射体积小于估计的细胞体积的50%，并且注射样品的流动速度几乎不导致可见的细胞质移位时，注射效果最好。
4 用紫外光可看到注入标记物后的活细胞，但会对细胞造成不可恢复的损伤，因此应尽可能缩短紫外光照射时间。
5 如果对已经注射的细胞进行免疫荧光测定或其他处理，最好使用可固定的葡聚糖，以防在冲洗中造成标记物的扩散损失。

磷酸钙细胞转染技术

[实验目的]
1 了解细胞转染技术原理和基本方法
2 磷酸钙沉淀法的基本技术要点

[实验原理]
磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。这种方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。

[仪器、材料和试剂]
1　呈指数生长的真核细胞（如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纤维细胞）
2　完全培养液（依所用的细胞系而定）
3　CsCl纯化的质粒DNA （10～50μg/次转染，二次纯化）
4　2×HEPES缓冲盐水(HeBS)
(pH6.95～7.05)　50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH调pH至6.95～7.05,过滤除菌后,-20℃保存备用。
5　2.5mol/L CaCl2过滤除菌,-20℃保存备用。
6　磷酸缓冲盐水（PBS）
7　37℃，5%CO2的加湿培养箱
8　100mm组织培养平板
9　15ml锥形管

[方法与步骤]
1　传代细胞准备　细胞在转染前24ｈ传代,待细胞密度达50%～60%满底时即可进行转染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培养液培养细胞。
2　DNA沉淀液的准备　首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于μL无菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。
3 用巴斯德吸管在500μL　2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
4 室温静置30min,出现细小颗粒沉淀。
5 将沉淀逐滴均匀加入10cm平板中，轻轻晃动。
6 在标准生长条件下培养细胞4～16h。除去培养液，用5ml　1×HeBS洗细胞2次，加入10ml完全培养液培养细胞。
7 收集细胞或分入培养皿中选择培养。

[注意事项]
1 在整个转染过程中都应无菌操作。
2 为获得最佳实验结果，DNA应不含蛋白质和酚。乙醇沉淀后的DNA应保持无菌，并在无菌水或Tris EDTA中溶解。
3 沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl2溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地粘附和进入细胞。
4 在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都可能导致磷酸钙转染的失败。

电穿孔和电融合技术

【实验目的】
1．了解细胞电穿孔和电融合的基本原理
2．学习电穿孔和电融合基本技术

【实验原理】
当细胞置于非常高的电场中，细胞膜就变得具有通透性，能让外界的分子扩散进细胞内，这一现象称为电穿孔。运用这一技术，许多物质，包括DNA、RNA、蛋白质、药物、抗体和荧光探针都能载入细胞。作为一种基因转导方法，电穿孔已被广泛用于各种细胞类型，包括细菌、酵母、植物和动物细胞；而且，它还能作为注射方法（称为电注射），把各种外源物质引入活细胞。与其他常用的导入外源物质的方法相比，电穿孔具有很多优点。首先，不必象显微注射那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。实际上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。
除了能使细胞膜具有通透性，让外界的分子扩散入胞液中以外，高强度的电场脉冲也能引起细胞融合，这一现象叫做电融合。然而，在用电脉冲融合前必须使细胞相互紧密接触，这一电融合方法在原生质融合制取杂交植物，胚胎细胞相互融合制备动物克隆方面非常有用，尤其在制取杂交瘤细胞制备单克隆抗体方面用处很大。几个实验室已证明使用电场电融合效率比常规的化学融合方法高10到100倍，最近，贴壁细胞的电融合还被用来研究细胞融合时细胞的骨架成分和细胞器的动力学重排。

【仪器、材料和试剂】
仪器：脉冲发生器；样品池（一个盛细胞的容器和两个平行的金属电极）；CO2培养箱，显微镜；离心机，微量移液器，镊子，剪刀，手术刀片，三角瓶，吸管，毛细管，离心管，载玻片，盖玻片，NALGEN一次性滤器。
材料：外源DNA，对数生长中期细胞
试剂：
穿孔介质（PM）：磷酸钾 15mmol/L
MgCl2 　1mmol/L
蔗糖（或甘露醇） 250mmol/L　
HEPES 10mmol/L　调节pH至7.3
融合介质（FM）：MgCl2 1mmol/L
甘露醇 280mmol/L
HEPES 　2mmol/L　调节pH至7.3

【方法与步骤】
悬浮细胞的电穿孔法：
1．电穿孔进行基因转移
电穿孔可用于将多种不同类型的分子载入活细胞中，操作步骤相似。本实验中，我们以基因转移为例。载入其他的分子时，只需把外源DNA换成所需分子即可。
1.1　使细胞在适宜的培养基中生长，用胰酶处理，收获对数生长中期的细胞，并用腺酶处理。
1.2　在穿孔介质（PM）中至少洗一次。洗细胞时，在台式离心机上1000rpm离心3分钟，使得悬浮细胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介质中重新悬浮细胞。
1.3　计数细胞，在PM中，浓缩细胞为大约1千万细胞/ml。
1.4　将DNA加到细胞悬液中，充分混合，使DNA均匀分散，用吸管吸一定体积的细胞-DNA混合液到装有电极的灭菌小样品池中。
1.5　在电穿孔装置上设置输出电压和脉冲宽度（脉冲宽度是指数衰减函数的时间常数，即τ=RC，C是电容，R是样品的电阻）。假如设备是CD脉冲型发生器，设定电容和并联电阻，以达到合适的τ值。
1.6　将小池放进盛样品的池中，启动电穿孔装置，供给所需的电脉冲。
1.7　电处理后，向小池加1ml普通培养基，将细胞混合液从小池转移到组织培养容器（培养皿或培养孔）中，再加入一些培养基使最终的培养基体积适量。然后，将样品细胞放回孵育箱中使之在正常条件下生长。
1.8　在测定转移基因的表达量前电穿孔细胞各自培养的时间不同。
2．检测电穿孔效率和细胞存活率
2.1 除用罗丹明偶联葡聚糖（1mg/ml）（分子探针）代替DNA外，将罗丹明偶联葡聚糖引入目标细胞的方法如前所述。
2.2 电穿孔后，用培养基洗涤细胞两次，去掉胞外的荧光葡聚糖。
2.3 电穿孔后30min，向细胞悬液中加30μl台盼蓝，孵育2min，然后用培养基洗涤。
2.4 在1000rpm下离心3min，收集细胞，将细胞重悬于PM中，终体积100μl。
2.5 将一滴细胞液（30μl）置于干净载玻片上，用盖玻片盖好，在显微镜下检测细胞，测定摄取荧光标记葡聚糖的百分数。
2.6 在亮视野镜片下，死细胞可因染成蓝色检测出（摄取了台盼蓝），测定细胞存活的百分数。
2.7 在各种电场设定值下重复实验，画出摄取葡聚糖率和细胞存活率对电穿孔参数的曲线。这一曲线就将显示对特定细胞类型电穿孔的最优条件。

悬浮生长细胞的电融合
融合悬浮细胞的步骤与电穿孔的很类似，只是在进行高强度的电场脉冲前后，必须用低幅、高频电场使细胞排成一条链。
1．用融合介质（FM）洗悬浮细胞两次，然后悬于FM中。洗涤细胞时，在台式离心机上1000rpm下离心3分钟，得到细胞沉淀，弃去上清液将细胞悬于新鲜FM介质中。
2．将悬浮细胞转移到相应的融合室内。假如要使两种不同的细胞彼此融合，转移前要充分混合。
3．启动介电电泳场，其振幅通常小于200V/cm，频率在2MHz以内，用显微镜检测细胞是否排成一条链，调节振幅和频率以达到最佳效果。
4．让介电电泳场开约1分钟后关掉，立即应用融合脉冲，其振幅数量级为1kV/cm。脉冲宽度小于1ms。在进行融合脉冲后立即再次启动介电电泳场，常规让其开启约2分钟。
5．关掉介电电泳场，让细胞在样品池中静置10分钟。
6．去掉FM，用普通培养基再次洗涤细胞。
7．将细胞转移到培养皿，加入普通培养基，在培养箱培养。

【注 意 事 项】
1．最优组分依使用的特定细胞种类而有明显的变化。如果努力优化电压和脉冲宽度电穿孔结果仍不令人满意，就应尝试改变穿孔介质。
2．影响电穿孔/电融合的另一重要因素与细胞状态有关，为达到最高效率，必须收集对数生长中期的细胞。