浅谈生物技术产品的质量控制
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2109
由于生物技术产品的复杂性及易变性，技术部门仅通过对终产品的质量检定难以实现对产品的全面质量控制，所以要保证产品的安全有效和质量可控，研制单位必须从原材料（包括菌、毒种或细胞库）、生产工艺、原液、半成品、成品到贮存条件等进行全程的质量控制。而如何建立一套完善的质量控制体系，对于生物制药来说是一项复杂的系统工程，需要我们在实践中不断地探索。本期编发的这组稿件则从技术审评的角度，分析了目前国内生物技术产品质量控制方面的现实状况，介绍了国外的一些通行标准和普遍做法，并对细胞库的建立、生产工艺的验证、质量标准的研究等五个方面提出了初步的建议和设想，值得研制单位参阅并思考。
制剂研究对稳定产品质量的意义
药物必须制成适宜的剂型才能用于临床，因此制剂的研究工作在新药研究与开发中占有重要的地位，对保证产品质量稳定也有更重要的意义。但由于生物技术产品性质一般不稳定，易受各种环境因素的影响，制剂研究有相当的难度。目前，国内制剂研究方面存在的主要问题是生物制药企业通常缺少制剂学方面的专业人员，而从事生物制品研究的工作者又缺少制剂学方面的知识，对制剂研究的重视程度也不够，所以制剂研究已成为我国生物技术药物研发中的一个薄弱环节。许多研究者在得到纯化的表达产物后便认为万事大吉，随意加入一种或多种常用的蛋白稳定剂（如人血白蛋白），即认为已完成了生物药物的研制工作。殊不知，不同的蛋白药物可能需要不同的制剂处方，不尽合理的处方组成不但影响制品的稳定性，而且可能会影响到成品的质控。比如，蛋白药物中加入人血白蛋白作为保护剂后，便很难再进行含量或纯度方面的分析，而且由于人血白蛋白属于血源性制剂，也给终产品带来了不安全的隐患。
以往国外生物制品的处方组成也较单一，但近年来一些国外企业对于这方面的研究工作越来越重视，像氨基酸、维生素、表面活性剂等安全性和稳定效果俱佳的辅料逐渐被采用，使生物技术药物的处方组成也越来越复杂，越来越多样。
质量标准有待完善
生物制品需进行全过程的质量控制，质量标准的建立和完善是这一过程中最重要的环节。与化学药物相比，生物制品的检定项目繁多且检定方法复杂，按照我国现行的技术标准，对于重组产品来讲，常规的检定项目就有20多项。近年来，随着国家生物制品规程的补充修订及GMP的实施，国内生物技术药物的质量标准更加规范，执行也更加到位，但对比国内外同类产品质量标准的差异，国内标准还有一些待改进的地方。
一、成品检定方面：目前国内生物技术药物的成品标准相对简单，与国际上的通行标准（如ICH）和国外企业的标准相比，缺少了含量和纯度方面的指标，这既不利于常规质控，又影响到成品的稳定性研究，甚至对上市后药品的质量监督产生影响。现在随着人们法制意识的加强，对药品质量问题的追溯逐渐成为制药企业和药品监管部门需要面对的一个问题，而成品质量标准的不完善很可能成为其中的一个隐患。过去由于技术和其它方面的考虑，大部分质控项目均在原液检定阶段完成。基于目前国内的技术水平，应该说是有可能进行改进的，如在成品检定中增加含量和纯度等方面的指标。研究者和审评者要开始重视成品的质控工作，我们希望由此起步，国内生物技术药物的成品检定工作能逐步得以加强和完善。
二、纯度及杂质分析：生物技术产品的纯度测定通常与检定方法直接相关，因此产品纯度应采用多种方法综合评估。目前国际上经常采用的纯度分析方法包括了SDS-PAGE、等电聚焦、分子筛HPLC、反相HPLC、离子交换HPLC等，而且为了将预期产品与杂质更好地分离，往往需要对样品进行预处理。以往国内生物技术药物一般仅采用SDS-PAGE和分子筛HPLC方法，测定结果只能说明样品在分子量方面是大致均一的，但难以全面反映产品的纯度。近来在大部分重组产品的检定中增加了反相HPLC分析，这是一个很有意义的改进。新的《药品注册管理办法》已将杂质分析纳入申报资料要求，研制单位今后应在纯度和杂质研究方面多做工作，特别重视产品相关杂质（指目标蛋白的分子变异体）的分析。
三、内控参比品的建立：ICH指导原则要求生产商在申报时应建立经标化的内部参比品，供生物学和物理化学检测用。国外企业标准中的理化分析结果判断大多也是要求与参比品一致。鉴于蛋白药物的特殊性质，采用某种特定方法测得的表观值与理论值相比通常有偏差，所以采用与内控参比品比较的方法更合理，也更能保证批间的一致性。一般情况下，国内的研究单位往往更重视活性测定用标准品（或参比品）的建立，而忽视了理化分析用参比品的建立，使某些理化检定标准难以制定或制定的标准范围过宽，所以研制单位应加强这方面的研究工作。当然，参比品的建立是一个系统工程，需要研制单位、检定部门和技术管理部门共同合作来完成。
四、判定标准的制定：标准的含义就是一个严格的衡量度，不但是厂家对自己产品的放行标准，同时也是政府和社会监督其产品质量是否合格的惟一尺度。由于生物制品的易变性，某些检测指标在贮存过程中难免发生变化，有时会给标准的制定带来困难。如在贮存过程中某种蛋白药物的氧化形式由5％增加到10％，而研究结果表明含10％氧化形式的药物仍是安全有效的，如果将合格标准拟定为小于5％，则投放市场后的产品检定结果可能不合格；如拟定为小于10％，则在贮存期内难以保证产品的安全有效。为了解决这种问题，国外有些企业采用两种标准，即出厂标准（releasespecification）和货价期标准（endofshelflifespecification），其中出厂标准高于有效期内标准，由此既可以保证产品在有效期内的检定结果都合格，又可以保证临床使用中的安全有效性，值得我们参考。
稳定性研究需进一步改进
由于生物制品一般稳定性较差，结构和性质又比较复杂，因此其产品内在质量的变化不易检测到，稳定性研究存在一定的难度。ICH已制定了生物技术产品稳定性研究的技术要求，其中对于批数和样品的选择、考察指标、考察条件、测试次数等均有明确的规定。对比该技术要求，目前国内生物技术产品稳定性研究中的问题较多，如考察批数少、考察条件单一（仅设温度条件，而不考虑光照、反复冻溶、冻干制品溶解后的稳定情况等）、考察指标少（缺少含量、纯度和降解产物等方面的分析）、对不同规格不同内包装的样品不分别考虑等。由于上述问题的存在，作为制定效期依据的稳定性研究数据通常不是很充分，对于贮存条件的规定不是很全面，有时根据有限的结果甚至难以确定产品的有效期。由于稳定性研究的缺欠很难在后续工作中弥补，所以我们建议研究者在开展稳定性研究前应加强咨询和论证，提出一个科学可行的试验方案，并应严格执行，以确保只要在效期内和规定的条件下使用，产品的安全性及有效性都是有保障的。鉴于我国目前尚未出台有关生物制品稳定性研究的技术指导原则，国内研制单位可参照国外的相关指南并结合自身的实际情况制定试验方案。
细胞库的建立和生产稳定的关系
建立细胞库的目的是为了保证生产的持续稳定。国外企业对于细胞库的管理有非常严格的要求，如对于哺乳动物而言，主细胞库（MCB）和生产细胞库（WCB）均需进行细胞表型、基因型、安全性等方面的检定。其中细胞表型检定项目包括细胞生长动力学、细胞形态、表达特性、同功酶分析、核型分析等；基因型分析包括限制酶谱分析、基因拷贝数、载体状态、核酸序列、mRNA水平检测等；安全性（外源污染）检查包括细菌及真菌、支原体检查和体内体外法检测各种病毒等。在成功建立两级种子库以后，研制单位还要定期进行常规检查，每次从WCB中取出细胞用于生产前，要进行细胞生长及表达特性方面的确认；同样，在建立新的WCB时研制单位对于MCB也要进行重新检定（如因意外事故造成MCB的全部损失，则需按严格的程序重建MCB）。采用新的MCB后，研制单位不但需进行药学方面的比较，必要时还需进行动物试验或临床试验，以确定重建MCB前后产品质量的一致性。为保证工程细胞在培养过程中具有稳定的遗传特性，对于发酵中或发酵结束后的收获液，研制单位还要进行细胞特性和基因序列的确认。
目前，我国传统的生物制品生产企业（如各大生物制品研究所）对于种子库的管理是比较重视的，基本都建立了一套严格、规范的管理体系。但部分新建的生物制药企业对此并未给予充分的重视，主要问题表现在缺少规范的管理体系、种子库的检测项目不全面及检定方法不合理等。从企业的申报资料看，上游研究工作也往往在种子库的建立和检定方面存在问题，特别是关于真核表达体系，因其管理体系及技术方法较复杂，所以出现的问题也特别多，几乎大部分的申报品种均需进行此方面的补充研究。问题主要表现为：只建立一级种子库，检定项目不全面，不按《中国生物制品规程》的要求进行支原体和病毒的检查等。
与国外相比，我国的现行技术要求也相对简单，而根据目前的现实情况及检测项目本身的重要性，我们建议研究者可考虑在种子库检定中增加目的基因序列测定项目，并规定对保存在种子库中的细胞进行定期的重复检定，每批从WCB中取出细胞投产前应进行必要的检定，对于至少一批培养终止的收获液应进行细胞鉴定和基因序列确认等。
生产工艺的验证值得重视
合理的生产工艺应能最大可能地提高目的产物的得率及保证终产品的纯度及活性，并可有效去除各种有害杂质。目前生物技术药物申报资料中的常见问题是工艺研究资料过于简单，即使提供了较详细的资料，也主要是对工艺流程摸索及工艺参数筛选的描述，缺乏关于工艺验证研究方面的资料，而这与申报者进行工艺研究的侧重点及我们过去的审评思路都有关。一般情况下，申报单位只提供不同工艺或参数比较的资料或文献资料，而对于工艺的提取及纯化效果却缺乏有效的验证，其实对于保证产品质量而言，后者的工作应更为重要。
国外一些生物制药企业的做法值得我们借鉴，如在工艺研究阶段，对每一步工艺去除外源杂质（如宿主DNA或有机溶剂等）的效果进行验证；在常规生产阶段，对某些重要的处理步骤（如除菌工艺）进行定期验证等。工艺验证的结果也将直接影响质控项目的设定，如FDA建议，经过工艺验证后，研制单位如能证实某些特定的步骤可有效地去除DNA，则在重组产品的质量标准中可取消残余宿主DNA检测项目。因此我们提醒研发者，应重视工艺效果的验证工作。
制剂研究对稳定产品质量的意义
药物必须制成适宜的剂型才能用于临床，因此制剂的研究工作在新药研究与开发中占有重要的地位，对保证产品质量稳定也有更重要的意义。但由于生物技术产品性质一般不稳定，易受各种环境因素的影响，制剂研究有相当的难度。目前，国内制剂研究方面存在的主要问题是生物制药企业通常缺少制剂学方面的专业人员，而从事生物制品研究的工作者又缺少制剂学方面的知识，对制剂研究的重视程度也不够，所以制剂研究已成为我国生物技术药物研发中的一个薄弱环节。许多研究者在得到纯化的表达产物后便认为万事大吉，随意加入一种或多种常用的蛋白稳定剂（如人血白蛋白），即认为已完成了生物药物的研制工作。殊不知，不同的蛋白药物可能需要不同的制剂处方，不尽合理的处方组成不但影响制品的稳定性，而且可能会影响到成品的质控。比如，蛋白药物中加入人血白蛋白作为保护剂后，便很难再进行含量或纯度方面的分析，而且由于人血白蛋白属于血源性制剂，也给终产品带来了不安全的隐患。
以往国外生物制品的处方组成也较单一，但近年来一些国外企业对于这方面的研究工作越来越重视，像氨基酸、维生素、表面活性剂等安全性和稳定效果俱佳的辅料逐渐被采用，使生物技术药物的处方组成也越来越复杂，越来越多样。
质量标准有待完善
生物制品需进行全过程的质量控制，质量标准的建立和完善是这一过程中最重要的环节。与化学药物相比，生物制品的检定项目繁多且检定方法复杂，按照我国现行的技术标准，对于重组产品来讲，常规的检定项目就有20多项。近年来，随着国家生物制品规程的补充修订及GMP的实施，国内生物技术药物的质量标准更加规范，执行也更加到位，但对比国内外同类产品质量标准的差异，国内标准还有一些待改进的地方。
一、成品检定方面：目前国内生物技术药物的成品标准相对简单，与国际上的通行标准（如ICH）和国外企业的标准相比，缺少了含量和纯度方面的指标，这既不利于常规质控，又影响到成品的稳定性研究，甚至对上市后药品的质量监督产生影响。现在随着人们法制意识的加强，对药品质量问题的追溯逐渐成为制药企业和药品监管部门需要面对的一个问题，而成品质量标准的不完善很可能成为其中的一个隐患。过去由于技术和其它方面的考虑，大部分质控项目均在原液检定阶段完成。基于目前国内的技术水平，应该说是有可能进行改进的，如在成品检定中增加含量和纯度等方面的指标。研究者和审评者要开始重视成品的质控工作，我们希望由此起步，国内生物技术药物的成品检定工作能逐步得以加强和完善。
二、纯度及杂质分析：生物技术产品的纯度测定通常与检定方法直接相关，因此产品纯度应采用多种方法综合评估。目前国际上经常采用的纯度分析方法包括了SDS-PAGE、等电聚焦、分子筛HPLC、反相HPLC、离子交换HPLC等，而且为了将预期产品与杂质更好地分离，往往需要对样品进行预处理。以往国内生物技术药物一般仅采用SDS-PAGE和分子筛HPLC方法，测定结果只能说明样品在分子量方面是大致均一的，但难以全面反映产品的纯度。近来在大部分重组产品的检定中增加了反相HPLC分析，这是一个很有意义的改进。新的《药品注册管理办法》已将杂质分析纳入申报资料要求，研制单位今后应在纯度和杂质研究方面多做工作，特别重视产品相关杂质（指目标蛋白的分子变异体）的分析。
三、内控参比品的建立：ICH指导原则要求生产商在申报时应建立经标化的内部参比品，供生物学和物理化学检测用。国外企业标准中的理化分析结果判断大多也是要求与参比品一致。鉴于蛋白药物的特殊性质，采用某种特定方法测得的表观值与理论值相比通常有偏差，所以采用与内控参比品比较的方法更合理，也更能保证批间的一致性。一般情况下，国内的研究单位往往更重视活性测定用标准品（或参比品）的建立，而忽视了理化分析用参比品的建立，使某些理化检定标准难以制定或制定的标准范围过宽，所以研制单位应加强这方面的研究工作。当然，参比品的建立是一个系统工程，需要研制单位、检定部门和技术管理部门共同合作来完成。
四、判定标准的制定：标准的含义就是一个严格的衡量度，不但是厂家对自己产品的放行标准，同时也是政府和社会监督其产品质量是否合格的惟一尺度。由于生物制品的易变性，某些检测指标在贮存过程中难免发生变化，有时会给标准的制定带来困难。如在贮存过程中某种蛋白药物的氧化形式由5％增加到10％，而研究结果表明含10％氧化形式的药物仍是安全有效的，如果将合格标准拟定为小于5％，则投放市场后的产品检定结果可能不合格；如拟定为小于10％，则在贮存期内难以保证产品的安全有效。为了解决这种问题，国外有些企业采用两种标准，即出厂标准（releasespecification）和货价期标准（endofshelflifespecification），其中出厂标准高于有效期内标准，由此既可以保证产品在有效期内的检定结果都合格，又可以保证临床使用中的安全有效性，值得我们参考。
稳定性研究需进一步改进
由于生物制品一般稳定性较差，结构和性质又比较复杂，因此其产品内在质量的变化不易检测到，稳定性研究存在一定的难度。ICH已制定了生物技术产品稳定性研究的技术要求，其中对于批数和样品的选择、考察指标、考察条件、测试次数等均有明确的规定。对比该技术要求，目前国内生物技术产品稳定性研究中的问题较多，如考察批数少、考察条件单一（仅设温度条件，而不考虑光照、反复冻溶、冻干制品溶解后的稳定情况等）、考察指标少（缺少含量、纯度和降解产物等方面的分析）、对不同规格不同内包装的样品不分别考虑等。由于上述问题的存在，作为制定效期依据的稳定性研究数据通常不是很充分，对于贮存条件的规定不是很全面，有时根据有限的结果甚至难以确定产品的有效期。由于稳定性研究的缺欠很难在后续工作中弥补，所以我们建议研究者在开展稳定性研究前应加强咨询和论证，提出一个科学可行的试验方案，并应严格执行，以确保只要在效期内和规定的条件下使用，产品的安全性及有效性都是有保障的。鉴于我国目前尚未出台有关生物制品稳定性研究的技术指导原则，国内研制单位可参照国外的相关指南并结合自身的实际情况制定试验方案。
细胞库的建立和生产稳定的关系
建立细胞库的目的是为了保证生产的持续稳定。国外企业对于细胞库的管理有非常严格的要求，如对于哺乳动物而言，主细胞库（MCB）和生产细胞库（WCB）均需进行细胞表型、基因型、安全性等方面的检定。其中细胞表型检定项目包括细胞生长动力学、细胞形态、表达特性、同功酶分析、核型分析等；基因型分析包括限制酶谱分析、基因拷贝数、载体状态、核酸序列、mRNA水平检测等；安全性（外源污染）检查包括细菌及真菌、支原体检查和体内体外法检测各种病毒等。在成功建立两级种子库以后，研制单位还要定期进行常规检查，每次从WCB中取出细胞用于生产前，要进行细胞生长及表达特性方面的确认；同样，在建立新的WCB时研制单位对于MCB也要进行重新检定（如因意外事故造成MCB的全部损失，则需按严格的程序重建MCB）。采用新的MCB后，研制单位不但需进行药学方面的比较，必要时还需进行动物试验或临床试验，以确定重建MCB前后产品质量的一致性。为保证工程细胞在培养过程中具有稳定的遗传特性，对于发酵中或发酵结束后的收获液，研制单位还要进行细胞特性和基因序列的确认。
目前，我国传统的生物制品生产企业（如各大生物制品研究所）对于种子库的管理是比较重视的，基本都建立了一套严格、规范的管理体系。但部分新建的生物制药企业对此并未给予充分的重视，主要问题表现在缺少规范的管理体系、种子库的检测项目不全面及检定方法不合理等。从企业的申报资料看，上游研究工作也往往在种子库的建立和检定方面存在问题，特别是关于真核表达体系，因其管理体系及技术方法较复杂，所以出现的问题也特别多，几乎大部分的申报品种均需进行此方面的补充研究。问题主要表现为：只建立一级种子库，检定项目不全面，不按《中国生物制品规程》的要求进行支原体和病毒的检查等。
与国外相比，我国的现行技术要求也相对简单，而根据目前的现实情况及检测项目本身的重要性，我们建议研究者可考虑在种子库检定中增加目的基因序列测定项目，并规定对保存在种子库中的细胞进行定期的重复检定，每批从WCB中取出细胞投产前应进行必要的检定，对于至少一批培养终止的收获液应进行细胞鉴定和基因序列确认等。
生产工艺的验证值得重视
合理的生产工艺应能最大可能地提高目的产物的得率及保证终产品的纯度及活性，并可有效去除各种有害杂质。目前生物技术药物申报资料中的常见问题是工艺研究资料过于简单，即使提供了较详细的资料，也主要是对工艺流程摸索及工艺参数筛选的描述，缺乏关于工艺验证研究方面的资料，而这与申报者进行工艺研究的侧重点及我们过去的审评思路都有关。一般情况下，申报单位只提供不同工艺或参数比较的资料或文献资料，而对于工艺的提取及纯化效果却缺乏有效的验证，其实对于保证产品质量而言，后者的工作应更为重要。
国外一些生物制药企业的做法值得我们借鉴，如在工艺研究阶段，对每一步工艺去除外源杂质（如宿主DNA或有机溶剂等）的效果进行验证；在常规生产阶段，对某些重要的处理步骤（如除菌工艺）进行定期验证等。工艺验证的结果也将直接影响质控项目的设定，如FDA建议，经过工艺验证后，研制单位如能证实某些特定的步骤可有效地去除DNA，则在重组产品的质量标准中可取消残余宿主DNA检测项目。因此我们提醒研发者，应重视工艺效果的验证工作。
