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细菌细胞壁的染色法和细胞质膜的观察

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实验十二 细菌细胞壁的染色法和细胞质膜的观察

  一、目的要求

  1.学习掌握细菌细胞壁的染色法。

  2.利用质壁分离法观察细菌的细胞壁和细胞质膜。

  二、基本原理

  细菌细胞壁很薄,革兰氏阳性菌的细胞壁为20—30nm,革兰氏阴性菌的细胞壁为10—13nm。组成细菌细胞壁的主要化学成分是肽聚糖,它与染料结合的能力差,不易着色,在细菌的染色过程中,一般情况染料都是通过细胞壁的渗透、扩散等作用而进入细胞,细胞壁本身并未染色,因此,欲通过染色来观察细胞壁,必须设法使细胞壁能着色,而细胞质则不易着色,常用的方法有单宁酸法和磷钼酸法。单宁酸和磷钼酸都是起媒染作用,它们使细胞壁形成可着色的复合物,而使细胞质不易被着色,经结晶紫或甲基绿染色后,便可在普通光学显微镜下观察到细胞壁。

  根据细菌细胞在高渗溶液中或用乙醚蒸气处理后,会产生质壁分离这一现象,经染色后也可在普通光学显微镜下区分细胞壁和细胞质膜。

  三、器材

  巨大芽孢杆菌(Bacillus megatherium),枯草芽孢杆菌;

  0.2%结晶紫水溶液,5%单宁酸(鞣酸)水溶液,1%磷钼酸水溶液,1%甲基绿水溶液,25%NaCl水溶液,0.01%结晶紫水溶液,Bouin氏固定液,0.1%硫堇(thionine)水溶液,乙醚,乙醚蒸气瓶等。

  四、操作步骤

  1.单宁酸法

  (1)将培养16—18小时的巨大芽孢杆菌按常法制成涂片。

  (2)用5%单宁酸染5分钟后,水洗。

  (3)用0.2%结晶紫染3—5分钟,水洗,吹干。用油镜观察,细胞壁呈紫色,细胞质呈淡紫色。

  2.磷钼酸法

  (1)制备浓厚的涂片,在未干时浸入1%磷钼酸水溶液3—5分钟。

  (2)用1%甲基绿水溶液染3—5分钟。

  (3)水洗后,吹干,用油镜观察。细胞壁为绿色,细胞质无色。

  3.区分细胞壁与细胞质膜

  (1)乙醚蒸气法

  (a)将巨大芽孢杆菌涂布于盖玻片上,翻转盖玻片使其放在乙醚蒸气瓶的瓶口上蒸3分钟。

  (b)取下盖玻片置Bouin氏固定液中30分钟后取出,水洗。

  (c)用硫堇染色30秒钟。

  (d)水洗,水封,置油镜下观察。

  (2)NaCl法

  (a)取一滴25%NaCl溶液于洁净的载玻片上。

  (b)挑一小环培养6小时的枯草芽孢杆菌,在25%NaCl水滴中涂布均匀,待自然干燥。

  (c)滴加0.01%结晶紫于其上,使盖满有菌部分,30秒钟后水洗,干燥,用油镜观察结果。

  五、实验报告

  1.结果

  绘图示细菌细胞壁与细胞质膜。

  2.思考题

  比较单宁酸法与磷钼酸法、乙醚蒸汽法与NaCl法之间的异同,根据你所做的试验认为哪种方法好?

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