细菌芽孢染色法

实验八 细菌芽孢染色法

　　一、目的要求

　　学习并掌握芽孢染色法。

　　二、基本原理

　　芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲合力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用一弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basicfuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可以进入菌体，而且也可以进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。

　　三、器材

　　枯草芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），生孢梭菌（Clostridium sporogenes）；

　　孔雀绿染液，番红水溶液，苯酚品红溶液，黑色素溶液等。

　　四、操作步骤

　　方法1、

　　（1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢杆菌，作涂片、干燥、固定。

　　（2）滴加3—5滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。

　　（3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约4—5分钟。这一步也可不加热，改用饱和的孔雀绿水溶液（约7．6％）染10分钟。

　　（4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

　　（5）用番红水溶液复染1分钟，水洗。

　　（6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

　　 方法2、

　　（1）取二支洁净的小试管，分别加入0．2ml无菌水，再往一管中加入1—2接种环的蜡状芽孢杆菌的菌苔，另一管中加入1—2接种环的生孢梭菌的菌苔，两管各自充分混合成浓厚的菌悬液。

　　（2）在菌悬液中分别加入0．2ml苯酚品红溶液，充分混合后，于沸水浴中加热3—5分钟。

　　（3）用接种环分别取上述混合液2—3环于两片载玻片上，涂薄，风干后，将载玻片稍倾斜于烧杯上，用95％乙醇冲洗至无红色液流出。

　　（4）再用自来水冲洗，滤纸吸干。

　　（5）取1—2接种环黑色素溶液于涂片处，立即展开涂薄，自然干燥后，油镜观察，在淡紫灰色背景的衬托下，菌体为白色，菌体内的芽孢为红色。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　绘图表示你观察到的两种芽孢杆菌的芽孢在形状、大小、着生位置上有什么不同？

　　2．思考题

　　为什么在孔雀绿染色液加热染色中，要待玻片冷却后才能用水冲洗？