电子显微镜
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实验五 电子显微镜
一、目的要求
1．了解电子显微镜的工作原理。
2．学习并掌握制备电镜标本的方法。
二、基本原理
1．电子显微镜的分辨力和放大率
电子显微镜是利用电子流代替光学显微镜的光束使物体放大成像而由此得名的。发射电子流的电子源部分称为电子枪，电子枪由发射电子的“V”形钨丝及阳极板组成，在高真空中，钨丝被加热到白炽程度，其尖端便发射出电子，发射出来的电子受到阳极很高的正电压的吸引，使电子得到很大的加速度而到达样品。电压越高，电子流速度越快，波长越短，其分辨能力也越强。一般用50—100kV电压时，电子波长在0．54—0．37nm，所以电子显微镜的分辨力极高，可达0．2nm左右，此分辨力比光学显微镜提高了近1000倍。
在电子流的通路上不能有游离的气体分子存在，否则由于气体分子与电子的碰撞而造成电子的偏转，导致物像散乱不清。因此，电子显微镜除需要高电压外，还需要高真空的装置。
电子显微镜的放大率是由透镜决定的，在电子显微镜中，透镜是由看不见的电磁场构成的，称为电磁透镜，简称磁透镜。由电子枪发射出的电子流可以通过磁透镜的磁场吸引发生偏折而放大物体，这与光学显微镜的光线通过玻璃透镜发生折射而放大物体的情况一样，但它不同于光学显微镜的是可利用多个磁透镜的组合而得到逐级放大的电子像，所以现代电子显微镜的成像系统由多个电磁透镜组成。而光学显微镜由于玻璃透镜本身存在有相差的缺陷，其放大率不能通过增加透镜的数目来无止境地提高。
此外，通过改变这些电磁透镜的磁场强度也可提高放大率。磁场越强，焦距越短，放大倍数也就越大。所以现代电子显微镜的成像物镜大多数采用短焦距的强磁透镜，放大倍数可达一百万倍以上。
图Ⅲ-12表示电子显微镜镜体剖面图。从图上可以看到构成电子显微镜的主要部件及其位置。
2．电子显微镜的成像原理
任何一个物体都是由原子组成的，原子则是由原子核与轨道电子组成的。当电子束照射到样品上的时候，一部分电子能从原子与原子之间的空隙中穿透过去，其余的电子有一部分会与原子核或原子的轨道电子发生碰撞被散射开来；一部分电子从样品表面被反射出来；还有一些电子是被样品吸收以后，样品激化而又从样品本身反射出来等。如果把所有这些不同类型的电子收集起来，使它们成像，便可以构成不同类型的电子显微镜（图Ⅲ—13）。这里只着重介绍透射电子显微镜和扫描电子显微镜。
（1）透射电子显微镜
从图Ⅲ-13可以看出透射电子显微镜收集的是透过样品的电子。在透射电子显微镜中，物像的形成主要来自电子的散射作用与干涉作用。散射作用分“弹性散射”和“非弹性散射”两种。弹性散射指电子和原子核发生碰撞，电子基本上不损失能量，而只是改变运动方向，这种碰撞称为弹性碰撞，这时候我们说电子发生了“弹性散射”作用。如果电子是和轨道电子发生碰撞，电子不仅会改变原来运动的方向，而且还会损失一部分能量，这时电子便发生了“非弹性散射”作用。
由于物体上不同部位的结构不同，它们散射电子的能力也各不相同，结果使透过样品的电子束发生疏密的差别，在散射电子能力强的地方，透过去的电子数目少，因而打在荧光屏上所发出的光就弱，显现为暗区；而散射电子能力弱的地方，透过的电子数目多，打在荧光屏上所发出的光就强，显现为亮区，这样，便在终像上造成了有亮有暗的区域，因而出现了反差，人眼就可以辨别。散射作用形成的反差造成强度上的变化，因此又称为“振幅反差”。由于在电子显微镜中利用的是人眼看不见的电子流，所以通常用一块荧光屏来把电子流转换成可见的荧光，使人眼可以接受。
除了散射作用能引起反差外，电子的干涉作用也能造成反差，在电子发生非弹性碰撞的时候，由于电子会失去一部分能量，因而使它前进的速度变慢，这部分速度减慢的电子会和速度不变的电子发生干涉作用，结果造成电子相位上的变化，从而也引起反差，称为“相位反差”。
在低倍观察时，振幅反差是主要的反差来源，而在高倍观察时，也就是在辨别极小的（如1nm大小）细微结构时，相位反差则起主要作用。
（2）扫描电子显微镜
与透射电子显微镜不同，扫描电子显微镜是把从样品表面反射出来的电子收集起来并使它们成像，所以又称反射电子显微镜。扫描电子显微镜的成像原理与电视或电传真照片的原理相似，由电子枪产生的电子束经过三个磁透镜的作用，形成一个很细的电子束，称为电子探针。电子探针经过透镜聚焦到样品表面上，按着顺序逐行逐行地通过样品，也就是对样品扫描，然后把从样品表面发射出来的各种电子（二次电子、反射电子等）用探测器收集起来，并转变为电流信号经放大后再送到显像管转变成图像。
扫描电子显微镜主要用来观察样品的表面结构，分辨力可达10nm，放大范围很广，可从20倍到几十万倍。透射电子显微镜的分辨力虽然很高，但是一般只能观察切成薄片后的二维图像，扫描电子显微镜能够直接观察样品表面的立体结构，并且具有明显的真实感。许多电子无法透过的较厚样品，只能用扫描电子显微镜才能看到。
光学显微镜、透射电子显微镜以及扫描电子显微镜的比较见图Ⅲ-14。
三、器材
铜网若干个，瓷漏斗，无菌镊子，无菌滴管，大头针，载玻片，细菌计数板，普通光学显微镜；
醋酸戊脂，浓硫酸，无水乙醇，无菌水，2％磷钨酸钠（pH6．5—8．0）水溶液；
大肠杆菌（大肠埃希氏菌，Escherichia coli）斜面。
四、样品制备
根据电子显微镜类型的不同，相应地也就有各种不同的样品制备技术，本实验主要介绍透射电子显微镜的样品制备技术。
由于电子显微镜的整个操作都需要在高真空中进行，所以被观察的微生物标本必须是干燥的，否则就会引起菌体细胞发生收缩变形。同时又因为电子流的穿透能力很弱，不能透过载玻片或较厚的标本，所以需要将标本放在由金属网作支架的火棉胶或聚乙烯甲醛薄膜上观察，此膜又称载膜或支持膜（扫描电子显微镜可用盖玻片）。
1．制作支持膜
支持膜的厚度一般在15nm左右，太薄会影响它的机械支持力，太厚
又会影响成像的分辨力。支持膜可用塑料膜（如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铍膜等）。在常规工作条件下，用塑料膜就可以达到要求。常用的金属网有铜网和不锈钢网。本实验以铜网火棉胶膜为例说明支持膜的制作方法。
（1）铜网的处理 铜网为圆形，直径一般是2．3或3．0mm，其规格有150、200、250目之分，其中比较常用的是200目（200个孔）。铜网在制膜前要清洗、脱水，否则会影响膜的质量和标本照片的清晰度。处理方法是先用醋酸戊酯浸漂若干小时后，用蒸馏水冲洗数次，然后再将铜网浸漂在无水酒精中进行脱水，最后将洗净的铜网放入瓷漏斗或小培养皿内，漏斗下面套上乳胶管，用止水夹控制水流。然后缓缓向漏斗内放入无菌水，其量为1cm左右，用无菌镊子尖轻轻排除网上的气泡，并将其均匀地摆在瓷漏斗的中心区域。
若铜网经以上处理仍不干净时，可用稀释的浓硫酸（1：1）处理1分钟左右，立即用无菌蒸馏水冲洗数次，然后放入无水酒精中脱水。
（2）配制火棉胶 将1．5g火棉胶溶于100ml醋酸戊酯中。
（3）制膜 用无菌滴管取上述火棉胶液滴在瓷漏斗的水面上，待醋酸戊酯蒸发，火棉胶则由于水的表面张力随即在水面上形成一层薄膜（勿振动），用镊子将它除掉，如此操作两次以清除水面上的杂质。然后再适量滴一滴火棉胶液以形成支持膜（火棉胶液滴的多少与膜的厚薄关系很大，要适量控制）。松开止水夹，缓缓放掉漏斗中的水，使膜自然下沉，并紧贴在铜网上，在此过程中切勿使膜皱折。最后在瓷漏斗上覆盖一洁净的纸，让膜自然干燥。
将干燥后的膜用大头针的针尖在铜网周围划破，再用无菌镊子小心地将铜网膜移到载玻片上，置普通光学显微镜下用低倍镜检查，挑选无皱折、完整无缺、厚薄均匀的铜网膜备用。
2．制片
有许多种制片方法，如直接贴印法、滴液法、负染色法和超薄切片法等。本实验介绍负染色法，此法常用来观察病毒粒子、高分子和细菌等。所谓负染色法是将样品用电子密度高，本身不显示结构且与样品几乎不反应的物质（如磷钨酸钠或磷钨酸钾）来包围样品，即不是被样品成分所吸附而是沉积到样品四周。如果样品具有表面结构，这种物质还能穿透进表面上凹陷的部分，这样，在有染液的重金属元素沉积的地方，散射电子的能力强，因而样品四周表现为暗区；在有样品的地方散射电子的能力弱，因而表现为亮区。这样便能把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。具体操作如下：
（1）将适量无菌水加入生长良好的大肠杆菌斜面内，用吸管轻轻拨动菌体制成菌悬液。用无菌滤纸过滤，并调整滤液中的细胞浓度为每毫升108—109个。
（2）取等量的上述菌悬液与等量的2％的磷钨酸钠水溶液（pH6．5—8．0）混合，制成混合菌悬液。
（3）用无菌毛细吸管吸取混合菌悬液滴在铜网膜上。
（4）经3—5分钟后，用滤纸吸去余水，待样品干燥后，先置低倍光学显微镜下检查，挑选膜完整、菌体分布均匀的铜网置电子显微镜观察。
为了保持形状，常用戊二醛、甲醛、饿酸蒸汽等试剂小心固定后再进行染色。其方法是将无菌水制备好的菌悬液经过滤，然后向滤液中加几滴固定液（如0．15％的戊二醛磷酸缓冲液，pH7．2），经这样预先稍加固定后，离心，收集菌体，制成菌悬液，再加几滴新鲜的戊二醛，在室温或4℃冰箱内固定一夜，次日离心，收集菌体，再用无菌水制成菌悬液，并调整细胞浓度为每毫升108—109个，然后按上述方法染色。
五、实验报告
思考题
（1）比较透射电子显微镜与普通光学显微镜的主要异同点。
（2）利用透射电子显微镜来观察的样品为什么要放在金属网作为支架的火棉胶膜（或其他膜）上？而扫描电子显微镜则可以将样品固定在盖玻片上？
（3）在用负染色法制片时，磷钨酸钠起什么作用？
