相差显微镜

 

实验四 相差显微镜

 

　　一、目的要求

　　1．了解相差显微镜的基本原理和用途。

　　2．学习掌握相差显微镜的操作技术。

　　二、基本原理

　　暗视野显微镜可以看到活细胞的外部形态，但是看不清内部结构。相差显微镜不仅能观察活细胞的形态，而且还能看到细胞内部结构以及细胞分裂的连续过程。

　　光线通过透明物体如活细菌细胞后，由于受透明物体中密度和折射率不同的物质的影响，部分光线变成了绕射光，光波的相位发生变化，而这种相位差不表现为明暗和颜色上的差异，不能在显微镜视野中观察到。相差显微镜就是将经过透明物体的直射光延迟或提前，并和绕射光产生干涉，使相位差变为振幅差。如果产生的干涉为相长干涉（图Ⅲ-8，R组光线），则振幅的同相量相加而变大，我们便看到较亮的部分；如果所产生的干涉为相消干涉时（如图Ⅲ-8，S组光线），则振幅异相量相消而变小，这部分就变得较暗。这样，变相位差为振幅差的结果，使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增加，能更清晰地观察活细胞的细微结构。

　　相差显微镜成像原理和装置如图Ⅲ-9所示。

　　在普通光学显微镜上增加下列四种附件就成为相差显微镜：

　　（1）环状光阑

　　相差显微镜的聚光镜光阑是环状光阑。照明光线只能从环状的透明区进入聚光镜再斜射到标本上（斜射角度远小于暗视野聚光镜）。大小不同的环状光阑成一转盘（图Ⅲ-10，A），安装于聚光镜下面，更换放大率不同的物镜时，要同时更换与其相应的光阑。

 

　　（2）相差物镜（镜头上标有PC或PH字样）

　　物镜的后焦平面上装有相板，这是相差显微镜的主要装置。相板上和环状光阑相对应的环状部分大多数是涂的吸收膜和推迟相位膜，其他部分完全透明。从标本上射过来的光线，绕射光部分穿过透明区；直射光则穿过相板的环状部分，光强度减弱，相位也适当改变。一般所用的相板推迟相位1/4，吸收80％的直射光，这样，就使直射光和绕射光的强度接近，而相位差则增大或减少。由于透明标本内部构造的折射率不同，产生绕射光的相位就会有不同程度的推迟，绕射光和直射光的干涉作用将相位差变成振幅差。

　　（3）绿色滤光片

　　为了获得良好的相差，最好用单色光线照明，一般选用绿色光线。

　　（4）合轴调整望远镜

　　为使环状光阑的中心与物镜的光轴完全在一直线上，必须拔出目镜，装上特别的低倍望远镜（图Ⅲ-10，B），使相板的暗环与环状光阑的明环合轴（图Ⅲ-11）。

　　三、器材

　　相差显微镜，1．0mm以下载玻片，0．16-0．17mm以下盖玻片；酿酒酵母水浸片，枯草芽孢杆菌水浸片。　

　　四、操作步骤

　　1．将酿酒酵母水浸片置载物台上，夹好。

　　2．转动聚光器下面的环状光阑转盘至“0”，并将光圈开到最大。

　　3．通过普通目镜和低倍相差物镜（如10×）调节焦距，看清标本。

　　4．转动转换器，使油镜相差物镜（90×）对准标本，同时转动环状光阑转盘至40，使与所用的物镜相符。

　　5．用细调节器调节焦距，使物像清楚。

　　6．取下目镜，换上合轴调节望远镜，转动望远镜使聚光镜中的亮环和物镜中的暗环看清楚。

　　7．转动聚光镜左右二侧的调节杆，使两环重合。

　　8．取下望远镜换上目镜进行观察，每更换标本或改变不同倍数的相差物镜时，都必须依上法重新合轴调节。

　　9．换上枯草芽孢杆菌的水浸片进行观察（必须先进行合轴调节）。

　　五、实验报告

　　1．结果

　　绘出你用相差显微镜所观察到的酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的形态结构。

　　2．思考题

　　为什么说相差显微镜适于观察活细胞的细微结构？