原理
利用暗视野显微镜可以进行活细胞观察，但是看不淸细胞的内部结构。而20世纪40年代出现的相差显微技术却使人们不仅能观察活细胞的形态，而且还能看到细胞的内部结构及其随时间变化的过程，为此，F.Zemike获得了1953年的诺贝尔物理学奖。
光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学显微镜现察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨，然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振蝠差（明暗差)，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较淸楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不淸的活细胞及细胞内的某些细微结构。
光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化，因此，用普通光学显微镜现察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨，然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置——环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振蝠差（明暗差)，从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较淸楚地观察到在普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不淸的活细胞及细胞内的某些细微结构。
图1 相差显微镜的成像原理及装置图
材料与仪器
酿酒酵母水浸片 枯草杆菌水浸片
相差显微镜聚光器 相差物镜 显微镜 合轴调节望远镜 绿色滤光片 载玻片 盖玻片
相差显微镜聚光器 相差物镜 显微镜 合轴调节望远镜 绿色滤光片 载玻片 盖玻片
步骤
1. 将显微镜的聚光器和接物镜换成相差聚光器和相差物镜，在光路上加绿色滤光片。
2. 聚光器转盘刻度置“0”，调节光源使视野亮度均匀.
3. 将酿酒酵母水浸片或枯草芽孢杆菌水浸片置于载物台上，用低倍物镜（10X）在明视野配光并聚焦样品。
相差显微镜镜检对载玻片、盖玻片的要求很离，载玻片厚度应在1.0 mm左右。若过厚，环状光阑的亮环变大，过薄则亮环变小；载玻片厚薄不均，凹凸不平，或有划痕、尘埃等也都会影响图像质量。而盖玻片的标准厚度通常为0.16-10.17 mm，过薄或过厚都会使像差、色差增加，影响观察结果。
4. 将聚光器转盘刻度置“10”（与所用10x物镜相匹配），注意由明视野转为环状光阑时，因 进光量减少，要把聚光器的光圈开足，以增加视野亮度。
5. 取下目镜，换上合轴望远镜。用左手指固定望远镜外筒，一边观察，一边用右手转动其内筒，使其升降，对焦使聚光器中的亮环和物镜中的暗环淸晰；当双环分离时，说明不合轴，可用聚光器的中心调节螺旋移动亮环，直至双环完全重合（图3，B）。
6. 按上法依次对其他放大倍数的物镜和相应的坏状光阑进行合轴调节。
精确的合轴调节是取得良好观察效果的关键，若环状光阑的光环和相塞物镜中的相位环不能精确吻合会造成直射光和绕射光的光路素乱，应被吸收的光不能吸收，该推迟相位的光波不能椎迟，失去相差显微镜的效果。
7. 取下望远镜，换回目镜，选用适当放大倍数的物镜进行观察。
常见问题
一、相差显微镜构造
相差显微镜与普通光学显微镜在构造上的不同在于用环状光阑代替可变光阑，用带相板的相差物镜代替普通物镜，及需用合轴调节望远镜来校直光轴并使用滤色片。
1. 环状光阑
相差显微镜的聚光器光阑是环状光阑，照明光线只能从环状的透明区迸人聚光镜再斜射到标本上（斜射角度远小于暗视野聚光器），产生直射光和绕射光。大小不同的环状光阑与聚光镜一起形成转盘聚光器，其转盘前端有标示孔，表示位于聚光镜下面的光阑种类，不同的光阑应与各自不同放大率的物镜配套使用。例如，标示孔的符号为“10”时，表示应与10×物镜匹配；符号为“0”时，为明视野非相差的通光孔（图2A）。
2. 相差物镜（镜头上标有PC或PH宇样）
物镜的后焦平面上装有相板，这是相差显微镜的主要装置。相板由与环状光阑相对应的环状共轭面和补偿面（共轭面的内外侧部分）两部分组成，分别透过直射光和绕射光。通过涂在相板上的吸收膜和推迟相位膜，直射光和绕射光会发生光强度减弱及相应改变，再通过两者的干涉作用，将相位差变为振幅差。如果是部分吸收直射光而推迟绕射光的相位可产生暗反差（形成明亮的背景和暗的标本），反之，如果是部分吸收绕射光而推迟直射光的相位则产生明反差（标本是明亮的而背景是暗的）。
3. 合轴调节望远镜
由于环状光阑的光环和相差物镜中的相位环很小，在合轴调节中必须使用特别的低倍望远镜（图2，B），保证两环的环孔相互吻合，光轴完全一致（图3）
进行相差显微镜观察时一般都使用绿色滤光片。这是因为相差物镜多属消色差物镜，这种物镜只纠正了黄、绿光的球差而未纠正红、蓝光的球差，在使用时采用绿色滤光片效果最好。另外，绿色滤光片有吸热作用（吸收红色光和蓝色光），进行活体观察时比较有利。
相差显微镜与普通光学显微镜在构造上的不同在于用环状光阑代替可变光阑，用带相板的相差物镜代替普通物镜，及需用合轴调节望远镜来校直光轴并使用滤色片。
1. 环状光阑
相差显微镜的聚光器光阑是环状光阑，照明光线只能从环状的透明区迸人聚光镜再斜射到标本上（斜射角度远小于暗视野聚光器），产生直射光和绕射光。大小不同的环状光阑与聚光镜一起形成转盘聚光器，其转盘前端有标示孔，表示位于聚光镜下面的光阑种类，不同的光阑应与各自不同放大率的物镜配套使用。例如，标示孔的符号为“10”时，表示应与10×物镜匹配；符号为“0”时，为明视野非相差的通光孔（图2A）。
图2 用于相差显微镜的环状光阑（A）和合轴调整望远镜（B）
2. 相差物镜（镜头上标有PC或PH宇样）
物镜的后焦平面上装有相板，这是相差显微镜的主要装置。相板由与环状光阑相对应的环状共轭面和补偿面（共轭面的内外侧部分）两部分组成，分别透过直射光和绕射光。通过涂在相板上的吸收膜和推迟相位膜，直射光和绕射光会发生光强度减弱及相应改变，再通过两者的干涉作用，将相位差变为振幅差。如果是部分吸收直射光而推迟绕射光的相位可产生暗反差（形成明亮的背景和暗的标本），反之，如果是部分吸收绕射光而推迟直射光的相位则产生明反差（标本是明亮的而背景是暗的）。
3. 合轴调节望远镜
由于环状光阑的光环和相差物镜中的相位环很小，在合轴调节中必须使用特别的低倍望远镜（图2，B），保证两环的环孔相互吻合，光轴完全一致（图3）
图3 相差显微镜照明合轴调整
A：环状光阑形成的亮环小于相板上暗环，B：正确照明，亮环与暗环重合，C：环状光阑中心不合轴。
进行相差显微镜观察时一般都使用绿色滤光片。这是因为相差物镜多属消色差物镜，这种物镜只纠正了黄、绿光的球差而未纠正红、蓝光的球差，在使用时采用绿色滤光片效果最好。另外，绿色滤光片有吸热作用（吸收红色光和蓝色光），进行活体观察时比较有利。
来源：丁香实验
