间接红血球凝集反应

间接红血球凝集反应（简称间接血凝）是间接凝集反应中应用最广的一种方法。

 

 

 

原理

以红血球为载体的间接凝集反应叫做间接血凝。将抗原吸附在红血球上用以检测微量抗体称为正向间接血凝，以抗体吸附于红血球上，检测相应的抗原，称为反向间接血凝。

用抗原吸附红血球，一般比较容易，但用免疫血清吸附红血球，则困难得多，而且往往不易获得良好的结果，因为免疫血清中的成分非常复杂。许多其他蛋白质和非抗体活性的免疫球蛋白占据红血球的表面，而影响血球的特异性凝集。

 

 

 

材料与试剂

1 ．红血球

2 ．反应板 分聚苯乙烯塑料板和有机玻璃板（聚甲基丙烯酸甲酯），每板又有 96 孔和 72 孔两种规格。按孔型又可分为 V 和 U 型两种， V 型具有更典型的凝集模型， U 型有时比 V 型的血清效价高 1 ～ 2 孔。反应板不能煮沸消毒和浸泡于来苏儿水中。消毒可用 0.5 ％甲醛溶液， 1 ％新洁尔灭及紫外线照射等。

3 ．稀释棒 由合金制成。棒头有 8 条沟，吸液量为 0.025ml ，通过火焰，使表面氧化变粗易于吸取液体。它的作用是蘸取、转移、混合液体。为了长期保持棒头的氧化层，每使用 20 次左右，应过火焰一次。

4 ．标准滴管 每滴 0.025ml 。

5 ．微型振荡器

6 ．兔血清盐水 作为稳定剂，用于悬浮致敏红血球以及稀释供试血清。制法为：无菌采取兔血，收集血清，灭活后 4 ℃ 保存。同时，取所需量加 4 倍量的 2.5 ％血球悬液，混匀， 37 ℃ 水浴 10min ，以吸附异嗜性凝集素，离心后取上清；再以 pH7.2PBS 稀释成 1 ％兔血清盐水，冰箱保存可供数日内之用。

7 ．抗原 尽可能使用高纯度的抗原。

8 ．供试血清或其它含抗体材料 供试血清必须灭活，加 9 倍 2.5 ％的红血球悬液， 37 ℃ 水浴 10min ～ 20min ，进行吸收，然后离心，取上清，即为 1 : 10 的血清稀释液。

9 ．醛化剂 甲醛、戊二醛、丙酮醛等。

10 ．优质鞣酸

11 ． 0.15Mol/L pH6.4PBS 液，用于红血球致敏。

12 ． 0.15Mol/L pH7.2PBS 液，用于一般稀释液。

13 ． 0.02 ％牛血清白蛋白 PBS 液

14 ．生理盐水

 

 

 

红血球的处理

1 ．新鲜红血球 新鲜红血球用阿氏液保存于 4 ℃ ，可供 3 周内使用。采用新鲜红血球做凝集反应，模型新鲜，典型，而且敏感性也比醛化红血球高出 1 ～ 2 个滴度。但用新鲜红血球致敏后，保存时间短，而且不同动物个体和不同批次来源的红血球均有差异，影响试验结果和分析。为了克服这一缺点，目前多采用醛化红血球或鞣化红血球。

2 ．红血球醛化极其优点

（ 1 ）醛化方法：常见的醛化剂有甲醛、戊二醛和丙酮醛。

甲醛醛化过程：①将红血球用 pH7.2PBS 反复洗涤 4 次，以除去血清蛋白以及红血球表面的胶体物质；②按 1 ︰ 8 的比例取红血球（压积）和 3 ％甲醛液（用 pH7.2PBS 稀释，预先冷却至 4 ℃ ），缓慢混合，加胶塞 4 ℃ 作用 24h ，不时摇动；③倾去上清液，再以 1 ︰ 2 （ V ／ V ）加入 36 ％～ 38 ％冷的（ 10 ℃ ）甲醛溶液，混匀，再放入 4 ℃ 24h ；④⑷离心去上清，以生理盐水反复洗涤 4 次。彻底清除甲醛液，最后以生理盐水配成 10 ％悬液甲醛化红血球，加 1 ／万硫柳汞防腐， 4 ℃ 保存。

戊二醛醛化过程：①取新鲜红血球，以生理盐水洗涤 4 次；②以 0.15Mol/L pH 7.2 PBS 配成 1 ％戊二醛溶液， 4 ℃ 保存备用；③将 100ml 1 ％冰冷的戊二醛液加入到 10ml ～ 15ml 红血球中，边加边搅拌（也可置电磁搅拌器上） 30min ；④离心去上清，以生理盐水洗涤 4 次，最后以 PBS 液（或生理盐水）配成 10 ％悬液，加 1 ／万硫柳汞， 4 ℃ 保存。

丙酮醛—甲醛双醛化过程：①取新鲜红血球，洗涤 4 次，配成 8 ％的悬液；②于红血球悬液中加等量的 3 ％丙酮醛室温电磁搅拌 16h ～ 18h ；③洗涤 5 次，再配成 8 ％的悬液；④于红血球悬液中加等量的 3 ％甲醛，电磁搅拌 16h ～ 18h ；⑤洗涤 5 次，最后以 pH 7.2 PBS 配成 10 ％的悬液，加 1 ／万硫柳汞防腐， 4 ℃ 保存。

（ 3 ）醛化红血球的优点：①性质稳定，不影响红血球表面的吸附能力；②重复性好，易标准化。③可较长期保存，醛化后 4 ℃ 保存，有效期可至 1 年，如冻干保存，有效期则更长。

（ 4 ）影响醛化的因素：①红血球的洁净程度：由于红血球表面残留血浆蛋白和其它胶质，易引起自家凝集，所以一定要充分洗净；②红血球的浓度：醛化时应尽量使红血球稀释度低一些，以减少红血球的凝集和变形；③醛化时的温度与醛化红血球的质量有很大关系，一般认为最好是 37 ℃ 。但有人认为应于 4 ℃ 进行醛化；④醛化剂的浓度和醛化次数：醛化剂的浓度过大，易引起红血球皱褶，浓度过低，又会增加溶血机会，所以一般以 3 ％醛化浓度为宜。家禽红血球一般醛化 1 ～ 2 次即可，而哺乳动物红血球醛化 2 次比醛化 1 次要好，敏感性高，保存时间也长。不同的双醛化，其抗原致敏作用有所不同。

表 各种双醛化红细胞的结果比较

 

脉冲／ min 是 ¹³¹ I 标记的特异性抗体结合到细胞上的指标，脉冲数越大，结合抗体量也越多。但是从表 5 － 1 中可以看出结合量同可测出的抗原滴度是不平行的。

适当的振荡可使醛化剂与红血球充分接触，并可排除凝块形成。但过分地振荡，则易产生气泡，引起红血球变形。

3 ．红血球鞣化 多糖、脂多糖、类脂等一些半抗原易于吸附红血球表面，所以一般醛化处理即可。但对于许多蛋白质抗原，由于不易吸附于红血球表面，所以在醛化的基础上，必须再以一定浓度的鞣酸进行处理，强化它对蛋白质的吸附能力。

 

有人认为双醛化后可不必进行 鞣化。首都医院做了“丙酮醛＋甲醛＋鞣化”和不加鞣化得出相同的抗原滴度。但多数意见认为醛化后仍需鞣化比较好。

(1) 鞣化过程：①将 10 ％醛化红血球用生理盐水洗涤 2 次，再以 0.15Mol/L pH7.2PBS 洗涤 1 次，最后以 PBS 配成 2.50 ％悬液；②称取优质鞣酸 20mg ，以生理盐水 4ml 配成 1 ﹕ 200 的浓度，于 37 ℃ 水浴，使之充分溶解，然后再以 pH7.2PBS 稀释成 1 ﹕ 2 000 的浓度。当天配制、当天用完；③ 1 份 2.5 ％红血球悬液与 1 份 1 ﹕ 2 000 鞣酸液充分混合， 37 ℃ 水浴 10min ， 1 500r ／ min 离心，去上清，用 PBS 液洗涤 1 次；④以 0.02 ％牛血清白蛋白 PBS 液洗涤 1 次，最后以牛血清白蛋白 PBS 配成 2.5 ％鞣化红血球。

（ 2 ）影响鞣化的因素：①鞣酸的质量：这是很重要的，所以必须采用优质鞣酸。分析纯的鞣酸呈面包屑状，不呈面粉状，有折光性；②鞣酸的浓度：浓度过高，可以出现红血球的凝集现象；浓度过低，达不到红血球的活化作用。醛化过的红血球所采用的鞣酸浓度一般比新鲜红血球高 10 倍。通常以 1 ： 2 000 为佳；③鞣化时间：鞣化过程一般 10min ～ 15min 即可完成。时间再长也不能吸附更多的抗原，提高血凝滴度。鞣化时采用的 pH 对吸附抗原和血凝滴度影响不大，一般采用 pH7.2 的 PBS 液。

 

 

 

红血球的致敏

1 ．致敏抗原剂量的确定 一般而言，在一定的范围内，抗原的浓度与试验的敏感性呈正比，超过这个范围，再增加抗原，敏感性不会再提高，而且过大，有时会引起非特异性凝集。当采用一种新的抗原时，必须经过试验，选择适当的抗原致敏浓度，即把抗原稀释成几个不同的浓度分别致敏红血球。再用这些致敏红血球分别与标准阳性血清进行试验，与标准阳性血清呈最高滴度的阳性反应的最小抗原剂量，即为该抗原的单位计量。致敏时，根据不同的抗原，可采用 2 ～ 4 个单位计量进行致敏。

2 ．致敏方法 各种抗原的致敏方法大致相同，一般蛋白质的致敏方法如下：

所需浓度的抗原 1 份

pH6.4PBS 液 4 份

2.50 ％的鞣化红血球悬液 1 份

混匀，置 37 ℃ 水浴 30min ，离心，沉淀后，以 2.5 ％兔血清生理盐水洗涤 1 次，悬浮于 1 份兔血清生理盐水中。

3 ．影响红血球致敏的因素
⑴要有高纯度或高效价的抗原或抗体。

⑵被致敏抗原或抗体的适当剂量和浓度。如抗体一般以 μg/ml IgG 为宜。抗猪瘟 IgG 一般用 80μg/ml ～ 160μg/ml ，抗口蹄疫 IgG 20μg/ml~40μg/ml ，抗猪水泡病 IgG 130μg/ml~160μg/ml ，抗猪肺疫 IgG 30μg/ml ~40μg/ml ，抗猪弓形体 20μg/ml~40μg/ml ，抗原一般用 0.2mg/ml ～ 1mg/ml 。

⑶ pH ：除鸡卵蛋白采用 4.6 ～ 5.1 外，其它通常采用 5.6 ～ 6.4 ，高于 7.2 或低于 4.6 均可使红血球发生自凝。

⑷致敏温度：一般为 37 ℃ ，范围是 20 ℃～ 40 ℃ 。

⑸致敏时间：一般采用 30min 为最适时间，具有良好的特异性和重复性。也有采用 60min 。时间过长，会造成红血球的形态不整，反应结果紊乱等。

⑹血球浓度：一般为 1 ％，范围为 0.5 ％～ 1.5 ％。

 

 

 

操作方法

 

可采用试管法、凹窝板法和微量法。前者稀释度准确、结果清晰、终点明确。后者具有节约材料、操作方便、结果出现迅速等优点。

试管法的供试材料用兔血清盐水二倍递减稀释，每管 0.50ml ，各管加致敏血球 0.05ml ，充分振荡，混匀后置室温，红血球完全沉下（需数小时）或过夜后判定结果。

每次试验需做下列对照：① 血清对照：最高浓度的血清＋鞣酸血球；②鞣酸血球对照：兔血清盐水＋鞣酸血球；③致敏血球对照：兔血清盐水＋致敏血球；④标准阳性血清对照：稀释已知滴度的阳性血清，加致敏血球以检验试验的敏感性是否前后一致。

 

 

 

结果判定

 

＋＋＋＋：管底呈细密的颗粒凝集，边缘不整齐。

 

＋＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，边缘折叠。

 

＋＋ ：全管底呈光滑的均匀片层，如伞状。

 

＋ ：管底大部分复以光滑片层，边缘稍厚。

 

± ：较“＋”面积更小，中央有沉积的红血球。

 

— ：红血球沉积在管底中央，如小圆盘或钮扣状。

 

以“＋＋”为滴度终点。