IgG的分离与提纯

互联网2013-11-14

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（一）材料与试剂配制

1．动物血清

2．硫酸铵饱和溶液

硫酸铵 800g~850g

H2O 1 000ml

加热至绝大部分溶质溶解为止，趁热过滤，置室温过夜，然后以28％NH4OH调pH至7.0（不调pH值也可以）。

注：硫酸铵以质量优者为佳，因次品中含有少量重金属对蛋白质巯基有影响。如次品必须除去重金属，可在溶液中通入H2S，静置过夜后滤过，加热蒸发H2S即可。

3．0.01Mol/L pH7.4PB液

A液：0.10Mol/L NaH2PO4液

NaH2PO4·2H2O 15.60g

加H2O至 1 000.ml

B液：0.10Mol/L Na2HPO4液

Na2HPO4·12H2O 35.80g

加H2O至 1 000ml

取A液19ml，B液81ml加水至1 000ml即可。

4．1％BaCl2溶液

5．纳氏液

HgI 115.00g

KI 80.00g

加H2O至 500.00ml

溶化后过滤，然后再加20％NaOH500.00ml，混合即可。

6．0.50 Mol/L的HCl液和0.50 Mol/L的NaOH液。

7．洗脱液：0.03Mol/L的NaCl液。

8．透析袋（或玻璃纸）。

（二）操作方法

1．取20ml血清，加生理盐水20ml，再逐滴加入(NH₄ )₂ SO4饱和溶液10ml，使成20％(NH₄ )₂ SO4溶液，边加边搅拌，充分混合后，静置30min。

2．3 000r/min离心20min，弃去沉淀，以除去纤维蛋白。

3．在上清液中再加（NH4）₂ SO4饱和溶液30ml，使成50％（NH4）₂ SO4溶液，充分混合，静置30min。

4．3 000r/min离心20min，弃上清。

5．于沉淀中加20ml生理盐水，使之溶解，再加(NH₄ )₂ SO4饱和溶液10ml，使成33％(NH₄ )₂ SO4溶液，充分混合后，静置30min。

6． 3 000r/min离心20min，弃上清，以除去白蛋白。重复步骤5，2~3次。

7．用10ml生理盐水溶解沉淀，装入透析袋。

8．透析除盐，在常水中透析过夜，再在生理盐水中于4℃透析24h，中间换液数次。

以1％BaCl2检查透析液中的SO4^2- 或以纳氏试剂检查NH4 （取3~4ml透析液，加试剂1~2滴，出现砖红色即认为有NH4 存在），直至无 SO4^2- 或NH4 出现为止。也可采用SephadexG25或电透析除盐。

9．离心去沉淀（去除杂蛋白），上清液即为粗提IgG （即γ球蛋白，如以36％的饱和硫酸铵沉淀血清的产物即为优球蛋白，Euglobin，含γ球蛋白)。

10．过DEAE－纤维素层析柱。（装柱过程见层析技术）。以0.01Mol/L pH7.4PBS（0.03Mol/L NaCl）洗脱，收集洗脱液。

也可采用SephadexG150或G200柱。

11．蛋白质及其定量鉴定（见本章第八节）。

12．IgG的纯度鉴定可采用下列方法之一鉴定。

⑴ 区带电泳：玻片琼脂或醋酸纤维膜电泳均可。加样电泳后，只在γ—球蛋白的迁移部位出现一条带。操作时，同时可用全血清样品，不同浓度（NH4）2SO4盐析样品进行电泳，以资比较。

⑵ 琼脂双相双扩散鉴定：预先准备该IgG免疫异种动物所获的抗IgG血清。将IgG与抗IgG血清进行双相双扩散，如IgG提纯的话，则在两样品孔之间出现一条沉淀线。

⑶ 免疫电泳鉴定：（操作见第三章免疫电泳部分）。孔内加待测样品，电泳后，在槽内加抗IgG血清，琼脂扩散24h，观察结果。如果提取的IgG纯的话，则只出现一条弧形的沉淀线，且沉淀线位于γ—球蛋白区。此鉴定必须同时进行全血清及抗血清抗体的免疫电泳，以资比较。

⑷ 圆盘电泳鉴定：用全血清样品及提纯样品同时进行圆盘电泳。全血清样品在圆盘电泳上出现数十条区带，而纯化的IgG则只有一条区带。

13．IgG的浓缩与保存

⑴ IgG的浓缩：参看本章第九节。

⑵ IgG的保存：一般浓缩至1％以上的浓度，再分装成小瓶冻干保存，或加0.01％硫柳汞在普通冰箱或低温冰箱保存，注意防止反复冻融。

（三）IgG的简易快速提取法

应用硫酸铵盐析及DEAE-纤维素层析法提纯化的IgG，不仅操作复杂、需时较长，处理过程中样品体积大大增加，而且透析时变性严重，容易引起抗体效价降低等。为了克服这一不足，特别是当大量提取IgG时，则往往采取下列的简易办法。

1． DEAE-纤维素直接提取法

取样品直接过DEAE-纤维素柱。下面介绍的是最为简单的烧杯法。

⑴ 以一定数量的DEAE52放入烧杯中，加入0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液，静置30min，去上清细粒，再重复一次。

⑵用布氏漏斗（内放两层滤纸）过滤。

⑶以5g湿重的DEAE-纤维素加1ml血清及3ml蒸馏水混合液的比例，加入各成分，充分搅拌。

⑷于4℃中放置1h，中间搅拌数次。

⑸用布氏漏斗抽滤，再用0.01Mol/L pH8.0PB缓冲液冲洗纤维素，抽滤。滤液即为提取的IgG液。

2．DEAE－SephadexA－50为弱碱性阴离子交换剂，经NaOH将Cl^- 型转变为OH^- 型后，可吸附酸性蛋白，血清中除γ－G属中性蛋白外其余均属酸性蛋白。当溶液的pH在6.5时，酸性蛋白均被DEAE－SephadexA－50吸附，只有γ－G留在溶液中。因此利用这一原理可以提取γ－G。这种提取法流程大大缩短，纯化前后样品体积变化不大，而且所得γ－G无变性现象。经过四次处理，其纯度也较好。缺点是收集量少，损耗大。

⑴ DEAE—SephadexA—50的处理。取DEAE－SephadexA－50若干克，悬浮于蒸馏水中，1h后倾去上层小颗粒，然后用0.50Mol/L NaOH处理1h，蒸馏水洗至中性，再用0.5 Mol/L HCl处理0.5h，水洗至中性，最后以0.01Mol/L pH6.5PB液平衡、抽干。

⑵ 取一定的血清量，加等量的0.01Mol/L pH6.5PB液，再加液体体积1/4的滤干的DEAE－SephadexA－50，混合、4℃放置1h，不时搅拌、抽滤、收集滤液。

⑶ 再用同样重量的DEAE－SephadexA－50处理滤液。反复处理三次。（全程共四次）。获得滤液即为γ－G制品。

⑷ DEAE－SephadexA－50的回收。用0.5Mol/L的Na2HPO4洗脱，抽滤至滤液中无蛋白（OD₂₈₀ ﹤0.04）后，再用蒸馏水洗至中性即可回收使用。

（四）禽血清IgG的分离与提纯（Na2SO4法）

1．试剂

⑴ 5％葡聚糖硫酸盐

⑵ 0.02Mol/L MnCl₂ 溶液

⑶ 无水硫酸钠

⑷ pH8.2硼酸盐缓冲液

⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB液

2．操作方法

⑴ 取禽血清10ml加5％葡聚糖硫酸盐液，0.40ml和0.025Mol/L MnCl₂ 1.00ml充分混合，静置，然后离心去沉淀，此步目的是为了去掉脂类物质。

⑵ 于上清液中加无水硫酸钠使每毫升血清含0.18g，缓慢加入，混匀，静置30min，3 000r/min离心去上清。

⑶ 以pH8.2硼酸盐缓冲液将沉淀稀释至原血清的一半再加硫酸钠使成0.16g／ml，同上法离心去上清。

⑷ 重复步骤⑶，加Na₂ SO₄ ，使成0.14g/ml。

⑸ 以少量硼酸盐缓冲液溶解沉淀，然后装透析袋除盐48h。

⑹ 过SephadexG200柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是IgM，第二峰主要是IgG。

⑺ 如要进一步提纯，则用第二峰再过DEAE—纤维素柱，以0.06Mol/L pH7.4 PB液洗脱，洗脱下来的蛋白液即为IgG。

也可以按以下操作方法进行：

⑴ 以18％硫酸钠（W/V）提取一次，再以14％的硫酸钠提取一次。

⑵ 将粗提的免疫球蛋白以PBS溶解，按9％加入无水硫酸钠，离心。再将上清按5％加入无水硫酸钠，离心。将两沉淀溶解、混合，在常水中透析过夜，再在生理盐水中4℃透析，直至无SO4^2- 为止。

⑶ 离心将上清液以pH8.0 0.20Mol/L PBS液平衡。

⑷ 过SephadexG200柱，以pH8.0 0.20Mol/L PBS液洗脱，收集洗脱液，取第二峰即为鸡IgG。