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谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定

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几乎所有植物中都存在淀粉酶,尤其是萌发的禾谷类种子,淀粉酶活性最强。主要是α-淀粉酶和β-淀粉酶。种子萌发时,淀粉酶活性随萌发时间迅速增加,将淀粉分解成小分子糖类,供幼苗生长。α-淀粉酶随机水解淀粉的α-1,4-糖苷键,作为淀粉分解的起始酶而起主要作用;其水解产物为麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖;β-淀粉酶水解非还原端的第二个α-1,4-糖苷键,水解产物为麦芽糖,并能使一部分糊精糖化。本实验以萌发种子为材料,测定其中α-淀粉酶和β-淀粉活性的差异。
【原理】
两种淀粉酶具有不同理化特性,α-淀粉酶不耐酸,在pH3.6以下迅速钝化;β-淀酶不耐热,在70℃下15min则被钝化。据此,在测定时钝化其中之一,就可以测定出另一种酶的活力,本实验采用加热钝化β-淀粉酶测出α-淀粉酶活力,再与非钝化条件下测得的总淀粉酶活力比较,求出β-淀粉酶活力。淀粉的水解产物麦芽糖及其它还原糖能与3,5-二硝基水杨酸试剂反应,使其还原生成红色3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,其颜色深浅与淀粉酶水解产物的浓度成正比,可用麦芽糖(或葡萄糖)浓度表示,用比色法测定淀粉生成的还原糖的量,以单位重量样品在一定时间内生成的麦芽糖的量表示酶活力。
【仪器与用具】
分光光度计;离心机;恒温水浴;研钵;具塞刻度试管(25ml×13);刻度吸管(1ml,2ml,5ml各1支);容量瓶(50ml×2)。
【试剂】
麦芽糖标准液(1mg/ml):称取100mg麦芽糖,用蒸馏水溶解并定容至100ml;
DNS试剂(3,5-二硝基水杨酸):精确称取3,5-二硝基水杨酸1g,溶于20ml 12mol/L NaOH溶液中,加入50ml蒸馏水,再加入30g酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞,勿使CO2 进入。若溶液混浊可过滤后使用;
0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液:
A液(0.1mol/L柠檬酸)—称取分析纯柠檬酸21.01g,用蒸馏水溶解并定容至1L;
B液(0.1mol/L柠檬酸钠)—称取柠檬酸钠29.41g用蒸馏水溶解并定容至1L;
取A液55ml与B液145ml混匀,即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液;
1%淀粉溶液:称取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。
【方法】
1.酶液提取:称取25℃下萌发3~4天的小麦种子1.0g(芽长1.0~1.5cm),置研钵中,加少量石英砂和2ml蒸馏水,研磨成匀浆后转入离心管中,用7ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管提取液在室温下放置提取15~20min,每隔数分钟搅动1次,使其充分提取。然后在3000rpm转速下离心10min,将上清液倒入50ml容量瓶中,加蒸馏水定容至刻度,摇匀,即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml,放入50ml容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度摇匀,即为淀分酶稀释液。
2.麦芽糖标准曲线制作:取7支干净的具塞刻度试管,编号,按表33-1加入试剂。
表33-1 制作麦芽糖标准曲线配方表
试 剂
管 号
1
2
3
4
5
6
7
麦芽糖标准液(ml)
0
0.2
0.4
0.8
1.2.
1.6
2.0
蒸馏水(ml)
2.0
1.8
1.6
1.2
0.8
0.4
0
麦芽糖含量(mg)
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
3,5-二硝基水杨酸(ml)
2
2
2
2
2
2
2
摇匀,置沸水中浴中煮沸5min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点,在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。
3.酶活力的测定:取6支干净的具塞刻度试管,编号,按表33-2进行操作。
表33-2 配活力的测定配方表
操作项目
管 号
Ⅰ-1
Ⅰ-2
Ⅰ-3
Ⅱ-1
Ⅱ-2
Ⅱ-3
 
淀粉酶原液(ml)
1.0
1.0
1.0
0
0
0
钝化β-淀粉酶
置70℃水浴中15min,取出后在流水中冷却
淀粉酶稀释液(ml)
0
0
0
1
1
1
DNS试剂(ml)
2.0
0
0
2.0
0
0
预保温
40℃恒温水浴中保温10min
1%淀粉溶液(ml)(40℃)
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
保温
40℃恒温水浴中准确保温5min
DNS试剂(ml)
0
2.0
2.0
0
2.0
2.0
摇匀,置沸水浴中5min,取出后冷却,加蒸馏水至20ml。摇匀,在540nm波长下比色,记录测定结果。
4.结果计算:用Ⅰ-2、Ⅰ-3吸光度平均值与Ⅰ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg),再按下式计算α-淀粉酶的活力(Aα ),淀粉酶活性以麦芽糖mg·g﹣1 ·min﹣1 表示:
Aα =
Ⅱ-2、Ⅱ-3吸光度平均值与Ⅱ-1吸光度值之差,在标准曲线上查出相应的麦芽糖含量(mg),按下式计算(α β)-淀粉酶总活力AT
AT
式中 A—淀粉酶活性,Aα 为α-淀粉酶的活性,AT 为淀粉酶总活性,主要是α、β淀粉酶的活性;
Cα —α-淀粉酶水解淀粉生成的麦芽糖量(查标准曲线求值,以下同);
CT —(α β)淀粉酶共同水解淀粉生成的麦芽糖量;
V1 —显色所用酶液体积(ml);
t—酶作用时间(min);
Vt —样液稀液总体积(α-淀粉酶为50ml,α β淀粉酶为500ml);
FW—样品鲜重(g)。

 

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