实验47 离体线粒体的氧化作用和磷酸化作用
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实验47 离体线粒体的氧化作用和磷酸化作用
原理
当供给植物充足的氧气时，植物细胞可使底物完全氧化。以葡萄糖作为呼吸底物完全氧化时，最后生成CO2 ，吸收的O2 被还原成水，并且每1摩（尔）葡萄糖的氧化产生38摩（尔）ATP：
C6 H12 O6 6O2 38ADP 38Pi→6CO2 6H2 O 38ATP
其中大部分ATP是通过称为氧化磷酸化作用形成的，这也是细胞内形成可利用能量的主要过程。现在可以肯定三羧酸循环及其与之相偶联的氧化磷酸化作用是在线粒体中进行的。在线粒体中进行这些反应的速度可用耗氧量来表示，也可用形成ATP的量来表示。
实验用黑暗中萌发的绿豆子叶或黑暗催芽的马铃薯块茎制备离体的线粒体，以琥珀酸为底物定性测定O2 的消耗和产生的ATP，并应用丙二酸抑制呼吸作用，观察耗O2 量的变化。
仪器药品
测氧仪 紫外分析灯
冷冻高速离心机 血色素吸管
玻璃板(6×20cm) 层析用玻璃缸
移液管 反应瓶
研钵 DEAE－纤维素(DE－22)
1．提取液：0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.0，含0.4mol/L蔗糖，5mmol/L EDTA(2.15g Na2 HPO4 ·12H2 O 0.544g KH2 PO4 0.186g EDTA 13.6g庶糖，用蒸馏水定容至100ml)。
2．反应液
(1)0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.0（见附表2）。
(2)1.5mol/L蔗糖溶液：25.67g蔗糖用蒸馏水定容为50ml。
(3)50mg/ml ADP：50mg ADP溶于1ml蒸馏水中。
(4)1mg/ml细胞色素c(cyt c)∶1 mg cytc溶于1ml蒸馏水中。
(5)3.3mg/ml氧化辅酶I(NAD)∶3.3mgNAD溶于0.5ml蒸馏水，用NaOH调至pH7.0，再定容为1ml。
(6)辅酶A(CoA)∶每支50单位，250单位相当于1mg。
(7)5mg/ml焦磷酸硫胺素(TPP)∶5mgTPP溶于1ml蒸馏水中。
(8)0.2mol/L MgCl2 ∶2.03g MgCl2 ·6H2 O溶于50ml蒸馏水中。
(9)1.1mol/L葡萄糖∶10.9g葡萄糖用蒸馏水定容为50ml。
(10)0.1mol/L琥珀酸∶0.118g琥珀酸溶于5ml蒸馏水中，用Na.OH调至pH7.0，再定容为10ml。
3．0.1mol/L丙二酸∶0.017g丙二酸溶于1ml蒸馏水中，用NaOH调至pH7.0，再定容为2ml。
4．0.025mol/L HCl。
操作步骤
1．线粒体悬浮液的制备
(1)25℃黑暗处萌发3─4天的绿豆芽，摘取子叶，去掉下胚轴、根和芽。
(2)取30g子叶，40ml提取液和少量石英砂在预冷的研钵中快速研磨成匀浆，双层纱布过滤。
(3)滤液于0℃下，3000r/min离心10分钟，弃去沉淀。
(4)上清液于0℃下，12000r/min离心20分钟，弃去上清液，沉淀悬浮于18ml提取液中。
(5)上述悬浮液在0℃，12000r/min下离心20分钟，弃去上清液，沉淀悬浮于2ml提取液中，即为线粒体悬浮液。保存在冰箱中。
2．仪器安装及调试
仪器安装及调试参阅实验88。
3．耗O2 量的测定
在反应瓶中按下表加入反应液。
在反应瓶侧臂中加入0.5ml线粒体悬浮液，插入氧电极，密闭反应瓶，待测氧仪稳定后，将侧臂内线粒体悬浮液轻轻倒入反应室（如反应瓶无侧臂，则用注射器吸取0.5ml线粒体悬浮液，自小孔中将其加入），在磁力搅拌器上搅拌。20℃下反应10分钟，记录氧分压的变化。由记录曲线比较的和加抑制剂的线粒体的耗O2 变化。
4．测定ATP的形成
(1)DEAE－纤维素的再生：使用以后的纤维素先用0.5mol/L NaOH溶液浸泡30分钟至1小时，然后用过滤漏斗滤去NaOH溶液，再用0.5mol/L HCl溶液浸泡30分钟至1小时，用蒸馏水冲洗至中性，备用。
已处理好备用的DEAE－纤维素，倾倒去过多的水，将纤维素搅匀后均匀地铺在干净的玻璃板上，然后轻轻振动玻璃板，使纤维素分布均匀，表面光滑。放在低于60℃烘箱中烘干备用。
(2)点样：用血色素吸管吸取(1)标准ATP10μl；(2)反应液20μl；(3)线粒体悬液20μl；(4)反应10分钟后的样品20μl，分别在DEAE－纤维素薄层板上点样，用冷风吹干。
(3)展层：层析缸中倒入0.025mol/L HCl，将纤维素薄层板平放入内，使液面低于点样线，盖好盖子，待前沿走到离薄层上端1cm时立即取出，用热风吹干。
(4)风干后的薄层板，在紫外分析灯下观察形成的ATP。
(5)实验结果记录于上表中。
